4Pi顕微鏡

4Pi顕微鏡は、軸方向分解能が向上したレーザー走査型蛍光顕微鏡です。これにより、通常500～700nmの軸方向分解能が100～150nmに向上し、標準的な共焦点顕微鏡の5～7分の1の体積でほぼ球形の焦点を実現できます。[1]

動作原理

解像度の向上は、2つの対向する対物レンズを用いることで実現されます。これらのレンズは、どちらも同じ幾何学的位置に焦点を合わせます。また、2つの対物レンズの光路長差は最小限に抑えられるよう慎重に調整されています。この方法により、両方の対物レンズの共通焦点領域に存在する分子は、両側からコヒーレントに照射され、反射光または発光光もコヒーレントに集光されます。つまり、検出器上で発光光をコヒーレントに重ね合わせることが可能です。照明と検出に使用される立体角は増加し、最大に近づきます。この場合、サンプルはあらゆる側面から同時に照射され、検出されます。 Ω {\displaystyle \オメガ}

4Pi顕微鏡の光学図

4Pi顕微鏡の動作モードを図に示します。レーザー光はビームスプリッターによって分割され、ミラーを介して2つの対向する対物レンズに導かれます。共通の焦点において、集光された2つの光ビームは重ね合わせられます。この位置で励起された分子は蛍光を発し、この蛍光は両方の対物レンズによって集光され、同じビームスプリッターで結合され、ダイクロイックミラーによって検出器に入射します。検出器では、2つの光路は再び重ね合わせられます。

理想的な場合、各対物レンズは の立体角から光を集めることができます。2つの対物レンズを使用すれば、あらゆる方向（立体角）から光を集めることができます。このタイプの顕微鏡の名称は、励起と検出に可能な最大の立体角に由来しています。実際には、対物レンズ1つで実現できる開口角は約140°で、これは に相当します。 Ω ＝ 2 π {\displaystyle \Omega =2\pi } Ω ＝ 4 π {\displaystyle \Omega =4\pi } Ω ≈ 1.3 π {\displaystyle \Omega \approx 1.3\pi }

この顕微鏡は3つの異なる方法で操作できます。タイプAの4Pi顕微鏡では、励起光のコヒーレントな重ね合わせによって解像度が向上します。発光光は片側のみから検出するか、両側から非コヒーレントな重ね合わせで検出します。タイプBの4Pi顕微鏡では、発光光のみが干渉します。タイプCモードで操作すると、励起光と発光光の両方が干渉するため、最高の解像度向上（共焦点顕微鏡と比較して光軸に沿って約7倍）が実現します。

実際の4Pi顕微鏡では、光をあらゆる方向から均等に照射または集光することができないため、点像分布関数にいわゆるサイドローブが生じます。通常（ただし常にではありませんが）、 4Pi顕微鏡では、これらのサイドローブを許容レベルまで低減するために、 2光子励起顕微鏡とエミッションピンホールを組み合わせて使用​​します。

歴史

1971年、クリストフ・クレマーとトーマス・クレマーは、完全なホログラム、すなわち点光源の放射の全フィールド情報を全方向に伝えるホログラムの作成を提案しました。[2] [3]しかし、1978年の出版物[4] は、不適切な物理的結論（すなわち、点状の光点）を導き出し、立体角の反対側を追加することによる実際の利点である軸方向解像度の向上を完全に見落としていました。[5]実用的な4Pi顕微鏡システム、すなわち2つの対向する干渉レンズを備えたセットアップの最初の記述は、1991年にステファン・ヘルによって発明されました。[6]彼は1994年にそれを実験的に実証しました。[7] 4 π {\displaystyle 4\pi }

その後数年間、この顕微鏡の用途は拡大しました。例えば、試料中の64スポットを同時に励起・検出する並列励起技術と、向上した空間分解能を組み合わせることで、2002年には4Pi顕微鏡を用いて酵母細胞内のミトコンドリアの動態を記録することに成功しました[8]。商用版は顕微鏡メーカーのライカマイクロシステムズ社によって2004年に発売されましたが[9]、後に製造中止となりました。

これまで、4Pi顕微鏡の最高画質は、誘導放出抑制（STED）原理などの超解像技術と組み合わせることで実現されてきました。[10]適切な励起ビームと脱励起ビームを備えた4Pi顕微鏡を用いることで、均一な50nmサイズのスポットを作成することができました。これは、固定細胞において共焦点顕微鏡と比較して焦点体積を150～200分の1に減少させたことに相当します。4Pi顕微鏡とスイッチングタンパク質を用いたRESOLFT顕微鏡を組み合わせることで、低光量下でも40nm未満の等方性解像度で生細胞を撮影することが可能になりました。[11]

参照

参考文献

  1. ^ J. Bewersdorf; A. Egner; SW Hell (2004). 「4π共焦点顕微鏡の成熟期」(PDF) . GIT Imaging & Microscopy (4): 24– 25.
  2. ^ Cremer C.、Cremer T. (1971) Punkthologramme: Physikalische Grundlagen und mögliche Anwendungen。特許出願 DE 2116521「Verfahren zur Darstellung bzw. Modifikation von Objekt-Details, deren Abmessungen außerhalb der sichtbaren Wellenlängen liegen」（可視波長を超える寸法を持つ物体の詳細の画像化および修正のための手順）の同封。 1971 年 4 月 5 日に提出。発行日 1972 年 10 月 12 日。ドイツ特許庁、ベルリン。 http://depatisnet.dpma.de/DepatisNet/depatisnet?action=pdf&docid=DE000002116521A 4 π {\displaystyle 4\pi }
  3. ^ 高解像度・高被写界深度レーザー走査顕微鏡に関する考察：C. CremerとT. Cremer、MICROSCOPICA ACTA VOL. 81 NUMBER 1 September、p. 31–44 (1978). 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の基本設計と共焦点レーザー走査4Pi蛍光顕微鏡の原理、1978年 Archived 2016-03-04 at the Wayback Machine .
  4. ^ C. CremerとT. Cremer (1978): 高解像度と被写界深度を備えたレーザー走査顕微鏡に関する考察 Microscopica Acta VOL. 81 NUMBER 1 September, pp. 31—44 (1978)
  5. ^ 2014年ノーベル化学賞 https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2014/hell/biographical/
  6. ^ 欧州特許 EP 0491289。
  7. ^ SW Hell; EHK Stelzer; S. Lindek; C. Cremer (1994). 「検出口径を拡大した共焦点顕微鏡：タイプB 4Pi共焦点顕微鏡」. Optics Letters . 19 (3​​): 222– 224. Bibcode :1994OptL...19..222H. CiteSeerX 10.1.1.501.598 . doi :10.1364/OL.19.000222. PMID  19829598. 
  8. ^ A. Egner; S. Jakobs; SW Hell (2002). 「高速100nm解像度3次元顕微鏡による生酵母ミトコンドリアの構造可塑性の解明」(PDF) . PNAS . 99 (6): 3370– 3375. Bibcode :2002PNAS...99.3370E. doi : 10.1073/pnas.052545099 . PMC 122530. PMID  11904401 . 
  9. ^ レビュー記事 4Pi顕微鏡。
  10. ^ R. Schmidt; CA Wurm; S. Jakobs; J. Engelhardt; A. Egner; SW Hell (2008). 「球状ナノサイズ焦点が細胞内部を解明」Nature Methods . 5 (6): 539– 544. doi :10.1038/nmeth.1214. hdl : 11858/00-001M-0000-0012-DBBB-8 . PMID  18488034. S2CID  16580036.
  11. ^ U. Böhm; SW Hell; R. Schmidt (2016). 「4Pi-RESOLFTナノスコピー」. Nature Communications . 7 (10504): 1– 8. Bibcode :2016NatCo...710504B. doi :10.1038/ncomms10504. PMC 4740410. PMID 26833381  . 
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