ブーム方式

ブーム法（別名ブーム核酸抽出法）は、生物学的サンプルから核酸を単離するための固相抽出法です。この方法は、「核酸（NA）をシリカビーズに吸着させる」という特徴があります。

概要

ブーム法（ブーム核酸抽出法）[1] [2] [3] [4] [5] [6] [ 7] [8]は、生物学的サンプルから核酸（NA） [9] を単離するための固相抽出法である 。この方法の鍵となるのはシリカビーズであり、シリカビーズはカオトロピック効果によりカオトロピック物質の存在下で核酸と結合することができる。この方法は、生物学的サンプルから核酸を単離するための最も広く普及している[6] [7]方法の一つであり、生物学的サンプルからの核酸の小規模精製のための 簡便、迅速、かつ信頼性の高い[2]方法として知られている。

この方法は、ウィレム・R・ブームらによって1990年頃に開発・発明されたと言われています。[注 1] カオトロピック効果は以前から知られており、他の科学者によって報告されていましたが、[10] [注 2] ブームらは、体液やその他の生物学的出発材料などの複雑な出発材料に対する方法の最適化に貢献し、[1] ブームらのUS5234809に従って短い手順を提供しました。[1]ブームらの特許[1]が提出された後、同様の出願[11] [12] [13]も他の関係者によって提出されました。

狭義には、「シリカ」という言葉はSiO 2結晶を意味しますが、他の形態のシリカ粒子も利用可能です。特に、非晶質酸化ケイ素やガラス粉末、アルキルシリカ、アルミニウムケイ酸塩（ゼオライト）、または-NH 2を含む活性シリカは、いずれもこの方法による核酸結合固相材料として適しています。今日では、磁性シリカ粒子を利用することを特徴とするBoom法の概念が広く利用されています。この方法では、磁性シリカビーズは、Tajimaピペット、[14] [15] [16] Pick pen(R)、[3] [4] Quad Poleコレクター、[17]などの磁性ビーズコレクターによって捕捉されます。

簡単な手順

図1：Tajimaピペットと磁性シリカビーズを用いたBoom法[14] 。Tajimaピペットの概略構造を図2に示す。装置と方法[14]は主に免疫系を対象としている。しかし、この特許では核酸抽出アッセイのための代替実施形態も言及されており、図1の手順はBoom法と概ね同様である。
図2：タジマピペットの概略構造

ブーム法における出発物質から核酸を分離する基本的なプロセスは、以下の4つのステップから構成される[1] [2] [3] [4]（図1参照）。

(a)出発物質の溶解および／または均質化。
出発物質の溶解物は、タンパク質分解酵素の存在下で界面活性剤を添加することにより得られる。

(b)カオトロピック物質とシリカビーズを出発物質に混合する
。 (a)の出発物質の溶解物をシリカビーズと十分な量のカオトロピック物質と混合する。カオトロピック効果により、遊離した核酸はほぼ瞬時にシリカビーズに結合し、シリカ-核酸複合体が形成される。核酸とシリカが結合する理由については、次のセクション（基本原理）で説明する。

(c)シリカビーズの洗浄
(b) のシリカビーズは、汚染物質を除去するために数回洗浄される。シリカ-核酸複合体（シリカビーズ）の洗浄プロセスは、通常、以下のステップで構成される。

  • 例えば、タジマピペット（図1、2参照）またはペレットダウン（急速沈降および上澄み液の廃棄）によって液体からシリカビーズを収集する。
  • 例えばボルテックスミキサーを使用して、シリカビーズをカオトロピック塩を含む洗浄緩衝液に混合する。
  • 上記の洗浄バッファーから再分散したシリカビーズを再度収集します。
  • さらにアルコール水溶液[注3]で洗浄し、次にアセトンで洗浄する。
  • ビーズは乾燥させることが望ましい。

(d)結合核酸の分離
カオトロピック物質の濃度を下げることで、純粋な核酸を緩衝液に溶出させる。洗浄（および好ましくは乾燥）されたシリカ-核酸複合体中に存在する核酸は、TE緩衝液、アクアビデスト緩衝液など、選択された溶出緩衝液に溶出される。溶出緩衝液の選択は、単離された核酸の想定される用途によって決定される。

このようにして、出発物質から純粋な核酸が分離されます。

実験条件、特に試薬（カオトロピック物質、洗浄バッファーなど）の組成を変更することで、より特異的な単離が可能になります。例えば、試薬の組成によっては、長い二本鎖DNAや短い一本鎖RNAの取得に適したものもあります。

出発物質として、全血、血清、軟膜、尿、糞便、脳脊髄液、精子、唾液、組織、細胞培養、食品、ワクチンなど、多種多様な生物学的試料が利用可能です。異なる出発物質や異なる種類の核酸（例えば、長鎖／短鎖、DNA／RNA、直鎖／環状、二本鎖／一本鎖）から得られる核酸の収量を最大化するには、手順の最適化が必要です。

現在、シリカコーティングされた磁性ビーズを用いたアッセイが最も一般的であると考えられます。したがって、この記事では、特に断りのない限り、「シリカビーズ」はシリカコーティングされた磁性ビーズを指します。

磁気ビーズ

シリカでコーティングされた様々な磁性粒子（磁性キャリア）は、シリカコーティングビーズとしてよく使用されます[18] [19] [20] マグヘマイト粒子（γ-Fe 2 O 3）とマグネタイト粒子（Fe 3 O 4）、およびそれらの中間の酸化鉄粒子は、磁性キャリアとして最も適しています。

一般的に、磁性ビーズの品質は以下のパラメータによって特徴付けられる：[18] [21]

  • 飽和磁化（～10-80 A m2/kg（emu/g）：超常磁性）、[18]
  • 保磁力（～0.80～15.92kA/m）、[18]
  • サイズ直径（～0.1-0.5μm）[18]
  • 各粒子の質量（約2.7 ng）[18] [注4]
  • 収集の容易さ（後述）[18]
  • 捕獲能力（後述）[18]
  • 沈降速度（30分で約4％）[21]
  • 面積比（> 100 m 2 /g）、
  • 有効密度（～2.5 g/cm 3）、および
  • 粒子数（～1 x 10 8粒子/mg）。[21 ]

ここで「収集の容易さ」は次のように定義され比較される。

「磁性ビーズを、生体物質を含む試料水溶液WmL（約1mL）中に少なくともZmg（約20mg）の量で分散させたとき、Yガウス（約3000ガウス）の磁場の存在下で、T秒（約3秒）以内にX重量％（約90重量％）以上回収する」

捕獲能力は次のように定義され比較される。

「生体物質を含む試料の水溶液WmL（～1mL）中に少なくともZmg（～20mg）の量で分散させたとき、そのBmg（～1mg）あたり少なくともAμg（～0.4μg）の生体物質と結合する」。

基本原則

この方法[1] [2] [3] [4] [14]の原理は、カオトロピック剤の存在下でのシリカ粒子または珪藻類の核酸結合特性に基づいており、カオトロピック効果に従います。

簡単に言えば、カオトロピック効果とは、水溶液中のカオトロピックアニオンが水の構造を乱し、疎水性相互作用を弱めることです。[22] [23]

広義には、「カオトロピック剤」とは、タンパク質や核酸の二次、三次、四次構造を変化させる能力を持つ物質を指すが、少なくとも一次構造はそのまま残す。[24]

カオトロピック塩の水溶液はカオトロピック剤である。カオトロピック陰イオンは、水素結合、ファンデルワールス力、疎水効果などの非共有結合力によって媒介される分子間相互作用を阻害することにより、系のエントロピー を増加させる。その例としては、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオン、 硝酸イオン、臭素イオン、塩素イオン、酢酸イオン、フッ素イオン、 硫酸イオン、またはこれらの組み合わせの水溶液が挙げられる。Boom法によれば、カオトロピックグアニジニウム塩としては、好ましくはチオシアン酸グアニジニウム（GuSCN）が用いられる。

カオトロピック効果によれば、カオトロピック剤の存在下では、核酸の主鎖のリン酸基のホスホジエステル結合から核酸の水和水が引き抜かれ、リン酸基が「露出」し、シリカと露出したリン酸基の間に疎水性相互作用が形成される。

自動化機器

タジマピペット

タジマピペット[14] [15] （図2参照）をベースにした核酸抽出装置は、ブーム法を実行するために最も広く普及している器具の一つである。[25]

タジマピペットは、精密計測機器メーカーであるプレシジョン・システム・サイエンス（PSS）[25]株式会社の創業者兼社長である田島秀次氏[14]によって発明されました。タジマピペットはPSS株式会社[25]のコアテクノロジーです。PSS 株式会社はこの技術に基づくOEM製品（例えばMagNA Pure(R)）を、ホフマン・ラ・ロシュ、ライフテクノロジーズなど、いくつかの大手試薬メーカーに提供しています。タジマら[14]の特許が出願された後、同様の特許出願[16]が他の関係者によっても出願されています。

タジマピペットは、対象物質と結合した磁性粒子を磁力で液体から分離し、液体中に懸濁させる磁性粒子制御方法と手順を実行します。

構成

ピペット自体は以下の部材から構成される装置である（図2参照）。[14]

各容器にアクセスして液体を吸引／排出できるように構成された ピペットチップであって、
フロントエンド部分、
貯留部、
液体の通路
前端部と貯留部とを接続し、
分離領域
磁場の作用を受ける液体通路内において、
メカニズム
ピペット部の内部に負圧または正圧を加えて磁性物質の懸濁液をピペット部に吸引または排出する
磁場源
ピペットチップの外側に隣接して配置され、
磁場源駆動装置
磁場源を駆動し、液体流路の外側から分離領域に磁場を印加したり、分離領域から磁場を除去したりする。磁石をピペットチップに近づけると磁場が印加され、ピペットチップから遠ざけると磁場が除去される。

タジマピペットを組み込んだ核酸抽出装置は、通常、以下のものから構成されます。[14]

上記の田島ピペット、
複数のチューブ。
上記のチューブ用の複数のチューブホルダー、
輸送手段
複数のチューブ間でタジマピペットを搬送する（チューブはチューブホルダーによって支持される）、および
制御装置
上記のデバイスを制御するため。

動議

(a) 磁性ビーズの捕捉。
この吸引過程において、ピペットチップの外側に配置された磁石によって、ピペットチップの外側からピペットチップの分離領域に磁場が印加されると、磁性ビーズを含む液体がピペットチップの分離領域を通過する際に、磁性粒子はピペットチップの分離領域の内壁に引き寄せられ、捕捉される。

その後、磁場が維持された状態で溶液を吐出すると、ピペットチップ内には磁性粒子だけが残ります。このようにして、磁性粒子は液体から分離されます。

田島[14]によれば、 混合液の好ましい吸引高さは、

液体の底レベルが液体通路の分離領域の下端よりも高い（つまり、液体の底レベルが磁石の下端よりも高い）。
混合液がすべて吸い上げられたら、
吸引された磁性粒子が完全に捕捉されることを確実にするため。

このとき、磁性粒子は濡れているため、ピペットチップの液体流路の分離領域の内面に付着したままになります。ピペットチップPを移動させたり運搬したりしても、磁性粒子は容易に剥がれません。

(b) 捕捉された磁性ビーズの再懸濁。

磁性粒子が上記の方法（a）によって捕捉された後、

磁性粒子が除去された混合液は液体収容部（容器）に排出され、磁性粒子のみがピペットチップ内に残る。

再停止手続きを行うことができます。

捕捉された磁性ビーズの再懸濁は、具体的には以下のステップから構成されます。もちろん、上記の方法によって捕捉された磁性物質の状態を、本研究で想定しています。

  • 洗浄バッファーなどの液体をチップに吸引する
  • 磁場の適用をやめる
「磁場の適用をやめる」ことで磁性粒子が液体中に浮遊します。
  • ピペットチップから容器へ液体（洗浄液など）を排出します（磁石本体から発生する磁力が遮断された状態）。

オペレーション

タジマピペットを組み込んだ核酸抽出装置の動作の一例は、図１に示す通りである。

その他の方法

磁性粒子捕捉装置の他のタイプの方法の例は以下のとおりです。

  • ペン型キャプチャ[3] [4]
  • チューブ型捕獲[17] [26] [27] [28]

参照

注記

  1. ^ Boomらの優先日、US5234809 [1]、EP0389063 [2]およびそれらの関連特許から推定。
  2. ^ 以下の論文は「Boomら、US5234809 [3]、EP0389063 [4]およびそれらの関連特許」で引用されています。
    • B VogelsteinとD Gillespie、「アガロースからのDNAの調製と分析的精製」PNAS 1979、第76巻、第2号、615-619頁。[5]
  3. ^ Boom のオリジナルの方法によれば、収量の損失を抑えるために 70% エタノールが好ましい。
  4. ^ 見積りの順序見積り手順は以下のとおりです。
    • 各粒子の半径（r）は約
    0.5μm 。 ＝ 0.5 1 10 6 100 1 c メートル ＝ 0.5 × 10 − 4 c メートル {\displaystyle =0.5{\frac {1}{10^{6}}}{\frac {100}{1}}cm=0.5\times 10^{-4}cm}
    • したがって、各粒子の体積（V）は約5.2×10 −13 cm 3で、
    V ＝ 2 × 2 3 π r 3 ＝ 4 3 π r 3 {\displaystyle V=2\times {\frac {2}{3}}\pi r^{3}={\frac {4}{3}}\pi {r}^{3}} 。
    • 磁性粒子がFe 3 O 4であると仮定すると、密度(D)は5.17 g/cm 3となります。
    • つまり、各粒子の重量（w）は約
    w=VD=2.7ページ

参考文献

  1. ^ abcdef Boom他; US5234809 [6]、EP0389063 [7]およびそれらの関連特許。
  2. ^ abcd R Boom, CJ Sol, MM Salimans, CL Jansen, PM Wertheim-van Dillen, J van der Noordaa;「核酸の迅速で簡便な精製法」J. Clin. Microbiol. 1990年3月 第28巻 第3号 495-503 [8]
  3. ^ abcde マティ・コルペラ; US6468810
  4. ^ abcde Bio-Nobileブランドのテクニカルノート [9]
  5. ^ ジョン・ブランスタイン著「サンプル抽出法：DNAとRNAの採取方法」[10] 2014年10月21日アーカイブ、Wayback Machine
  6. ^ ab https://www.hanc.info/labs/labresources/procedures/ACTGIMPAACT%20Lab%20Manual/Standard%20Roche%20Monitor%20Test,%20Boom%20Extraction.pdf [永久リンク切れ]
  7. ^ ab Guido Hennig、Christoph Petry、Ellen Sampson. 「in vitro使用のための核酸分離の自動化により、分子診断ラボにおけるアッセイ性能が向上」（PDF）。Siemens。
  8. ^ SPRI ビーズはどのように機能しますか?
  9. ^ 「大量血液からのDNA抽出法」。2008年10月15日時点のオリジナルよりアーカイブ。2013年4月12日閲覧。
  10. ^ B VogelsteinとD Gillespie、「アガロースからのDNAの調製と分析的精製」PNAS 1979 vol. 76 no. 2 pp.615-619 [11]
  11. ^ 「US5342931」.
  12. ^ 「US5973138」.
  13. ^ 「磁性粒子を使用したDNAの精製と分離」。
  14. ^ abcdefghij Hideji Tajima;US5702950 [12], US6331277 [13], US 2001/0007770 A1 [14] およびそれらの関連特許。[15]も参照。2013年4月11日アーカイブ、archive.today。
  15. ^ ab 田島秀次;US6509193 [16]
  16. ^ ab 「磁性微粒子の分離装置および方法」。
  17. ^ ab 「外部磁気手段を特徴とする磁気分離装置および方法」。
  18. ^ abcdefgh 「生体物質用磁性キャリア、その製造方法およびそれを用いた生体物質の分離方法」。
  19. ^ 「核酸結合性磁性キャリアおよびそれを用いた核酸の単離方法」
  20. ^ 「シリカ磁性粒子を使用して生物学的標的物質を分離するためのキット」。
  21. ^ abc Magnetic Particles Archived December 3, 2013, at the Wayback Machine (日本語)
  22. ^ フリーマン、ローレン. 「GENECLEAN課題」www.bio.davidson.edu .
  23. ^ maxXbond: DNA結合シリカマトリックスの最初の再生システム KH Esser、WH Marx、T Lisowsky – Nature Methods|アプリケーションノート、2006 [17][18] 参照、[19]
  24. ^ 「CHAOTROPICの医学的定義」www.merriam-webster.com。
  25. ^ abc プレシジョン・システム・サイエンス株式会社（PSS）のウェブサイト[20]（日本語）を参照 。 米国支社のウェブサイトは[21]。
  26. ^ 「磁石を用いた磁性粒子の処理方法および生物学的分析装置」
  27. ^ 「磁性粒子を処理するための装置および方法」。
  28. ^ 「磁性粒子を流体と混合するための装置および方法」。
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