サイクリングプローブ技術（CPT）は、特定のDNA配列を検出するための分子生物学的手法である。CPTは等温条件下で動作する。用途によっては、CPTはPCRの代替として利用できる。しかし、PCRとは異なり、CPTでは標的DNA自体の複数のコピーが生成せず、シグナルの増幅は線形である。これは、PCRにおける標的DNAの指数関数的増幅とは対照的である。CPTでは、相補的な標的DNA配列にハイブリダイズしてRNase Hの基質となる、配列特異的なキメラプローブを使用する。RNAのヌクレオチド間結合部で切断が起こり、プローブが標的から解離して次のプローブ分子が利用できるようになる。[1] CPTで使用するための統合型電気運動システムが開発されている。[2]
プローブ
サイクリングプローブ技術は、キメラ核酸プローブを用いて特定のDNA配列の存在を検出する技術です。キメラプローブは、 2つのDNAセグメントに挟まれたRNAセグメントで構成されています。RNAセグメントは4つの連続したプリンヌクレオチドを含みます。プローブの長さは30ヌクレオチド未満で、プローブ内およびプローブ間の相互作用を最小限に抑えるように設計する必要があります。[3]
プロセス
サイクリングプローブ技術は、キメラプローブと標的DNAのハイブリダイゼーションから始まる等温循環プロセスを利用する。ハイブリダイゼーション後、プローブはRNase Hの適切な基質となる。エンドヌクレアーゼであるRNase HはプローブのRNA部分を切断し、2つのキメラ断片を生成する。新たに切断された断片の融点（T m）は、元のプローブの融点よりも低い。CPT反応は元のプローブの融点よりわずかに高い温度で等温に保たれるため、切断された断片は標的DNAから解離する。解離後、標的DNAは新しいプローブと自由にハイブリダイズし、サイクルが再開される。[3] [4]
断片は切断・解離すると検出可能となる。断片を検出するための一般的な戦略は蛍光である。この方法では、プローブの5'末端に蛍光マーカーを、3'末端にクエンチャーを付加する。 [4] [5] RNase Hがプローブを切断すると、クエンチャーと蛍光マーカーが分離し、蛍光マーカーの強度が増加する。切断された断片は、増幅（例： PCR）や他の化学的検出手段を可能にするための更なる改変によって検出することもできる。 [6]
標的DNA濃度が低い場合、CPTプロトコルを変更することで特異性と効率性を高めることができます。割り当て時間を長くすると、プローブの切断効率が向上することが示されています。[4] RNase H濃度を高めることと、プローブ間およびプローブ内相互作用を起こしにくいプローブを使用することで、特異性が向上することが示されています。[3]
利点
サイクリングプローブ技術は標的DNAの増幅を伴わないため、CPTはPCRよりもクロスコンタミネーションのリスクが低い。 [3] [4]さらに、CPTはPCRよりも高速であり[4] 、専用のサーモサイクラーを必要としない。また、CPTではCPT産物をゲル上で泳動する必要もない。
デメリット
CPTには特殊なキメラプローブが必要であるため、CPTアッセイはPCRよりも高価になります。[5] CPTプローブは非常に特異性が高いため、それぞれのアッセイごとに新しいプローブを設計する必要があり、コストがさらに増加します。臨床導入は経済的に困難であるだけでなく、検体にRNase H以外の非特異的RNaseが含まれる可能性も制限となります。[3]
アプリケーション
CPTは特定のDNA配列、ひいては特定の遺伝子型を検出するために使用できます。例えば、CPTは遺伝子組み換え作物と非遺伝子組み換え作物を区別するために使用できます。[5]臨床的には、CPTは病原体の抗菌薬耐性を検出するために細胞培養の代替として使用できます。 [4]
CPTは、本質的には、サンプル中に特定の配列が存在するかどうかを検出するものです。しかし、切断されたプローブは線形速度論に従って蓄積するため、標的DNAの量を定量化することができます。そのため、CPTは生物中の非コード反復配列の数を定量化するために使用されてきました。[3]
CPTは分子ビーコンやqPCRなどの他の技術と組み合わせて使用することができます。[7]
参考文献
- ^ Bhatt R, Scott B, Whitney S, Bryan RN, Cloney L, Lebedev A (1999). 「磁性粒子を用いたサイクリングプローブ技術による核酸の検出：高感度と分離の容易さ」. Nucleosides & Nucleotides . 18 ( 6–7 ): 1297–9 . doi :10.1080/07328319908044696. PMID 10474219.
- ^ Tang T, Badal MY, Ocvirk G, Lee WE, Bader DE, Bekkaoui F, Harrison DJ (2002年2月). 「シグナル増幅法を用いた遺伝物質分析のための統合型マイクロ流体電気泳動システム」.分析化学. 74 (4): 725–33 . doi :10.1021/ac010874j. PMID 11866051.
- ^ abcdef Beggs ML, Cave MD, Marlowe C, Cloney L, Duck P, Eisenach KD (1996年12月). 「サイクリングプローブ反応におけるMycobacterium tuberculosis複合体の直接反復配列の特性評価」Journal of Clinical Microbiology . 34 (12): 2985–9 . doi :10.1128/JCM.34.12.2985-2989.1996. PMC 229446. PMID 8940435 .
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