シトクロムP450エンジニアリング

この記事では、シトクロム（CYP）P450酵素のタンパク質工学[1]について説明します。P450は、さまざまな生化学的異化および同化プロセスに関与しています。[2]天然のP450は、水酸化、N、O、S-脱アルキル化、エポキシ化、スルホキシド化、アリール-アリールカップリング、環の縮小と拡大、酸化的環化、アルコール/アルデヒドの酸化、不飽和化、窒素酸化、脱炭酸、ニトロ化、酸化的および還元的脱ハロゲン化など、いくつかの異なるタイプの化学反応を実行できます。[2] [3]工学的取り組みでは、1)安定性の向上、2)活性の向上、3)基質範囲の改善、4)非天然の反応を触媒する能力の有効化を目指している場合が多いです。[4] [5] P450工学は、化学生物学および合成有機化学（化学酵素学）の分野で新興分野です。

シトクロムP450酵素の工学的アプローチ

ラショナル

合理的な酵素工学は、機構的または構造的情報に基づいて特定のアミノ酸変異を行うことを特徴とします。P450酵素は機構的にはよく理解されていますが、構造情報に基づく変異は結晶化の難しさによってしばしば制限されます。[4] [5]しかし、P450酵素は高い柔軟性と活性部位の可塑性を有しており、結晶構造が得られたとしても、合理的な設計において結晶構造はほぼ不要になります。[5]基質の適用範囲を拡大しようとすると、別の問題が生じます。これは多くの場合、P450活性部位のサイズを大きくすることで達成されますが、その結果、基質のドッキング方向が複数になり、位置選択性/立体選択性が低下する可能性があります。[5]

指向性進化

指向性進化は、実験室環境で自然選択を模倣するように設計された酵素工学戦略である。[2] [4] [5]合理的な設計戦略の実施が困難であることから、指向性進化はP450工学において選択される戦略となっている。この場合、変異は、部位飽和 突然変異誘発を介して、半合理的またはランダムに導入することができる。得られたP450変異体（通常は変異体ライブラリ）は、所望の活性についてスクリーニングされる。[5] [6] [7]強化された特性を示す変異体は、次の変異誘発ラウンドに送られ、所望の機能が十分に満たされるまでこのサイクルが繰り返される。

P450のエンジニアリング例

P450 BM3

P450 BM3（別名CYP102A1）は、バチルス・メガテリウムから単離されたシトクロムP450酵素である。[2] [4] [5] [6] [8] BM3は、その溶解性、扱いやすい細菌アイソフォーム、自給自足の電子伝達系のため、またその合成上の有用性のため、酵素工学の観点から広範に研究されてきた。[8]工学的研究により、BM3変異体は、1) 新しい差別化された基質範囲を付与できること、2) 新しい基質に対して位置/立体選択性を示すこと、3) 新しい基質に対して高い選択性と活性を示すように工学的に操作できることがわかった。[5] [6] [8] BM3変異体は、特に香料、風味料、フェロモン、医薬品の 製造に有用である。[8]アルテミシニック酸（医薬品天然物 アルテミシニンの製造に使用）は、アモルファ-4,11-ジエンに存在する2つのアルケンをエポキシ化する役割を担うBM3変異体を利用して製造された。 [8] [9]バレンセンからヌートカトン（グレープフルーツの高級フレーバー）への酸化は、F87TおよびI263A変異体を利用して達成された（図1）。[8]

図1. P450 BM3 F87T I263A変異体を用いた(+)-バレンセンの酸化

最近、Wangらは、スチレン化オレフィンのシクロ プロパン化が可能なBM3変異体を報告した。[6]天然のBM3はシクロプロパン化活性が低いため、酵素工学の取り組みが行われた。本質的には、P450はヘムチオレート酵素であり、分子状酸素（O2）とNAD（P）Hを利用して酸素化反応を行う。[10]そのため、BM3は、オレフィンの存在下ではシクロプロパン化反応ではなくエポキシ化を行うことを好む。[6]遷移金属触媒を用いて電子不足オレフィンをエポキシ化することは困難であることが知られているため、ジアゾ酢酸エチル（EDA）と1の反応がモデル反応として選択された（図2）。[6]この反応は化合物2を生成し、これは臨床的うつ病の治療に使用される医薬品であるレボミルナシプラン（フェツィマ）に簡単に変換できる。[6]まず、触媒中心の軸配位システイン残基をセリン、アラニン、メチオニン、ヒスチジン、チロシンなどのアミノ酸に置換した変異体を作製した。軸ヒスチジン配位子を有する変異体T268A-axHは、EDAと1の反応を81%の収率、6:94のジアステレオ選択性、42%のエナンチオ選択性で触媒した。[6]その後、部位飽和変異誘発を複数回行い、BM3-Hstar（T268A-axH、L437W、V78M、L181V変異を含む）と名付けられた変異体が得られた。この変異体は、モデル反応を92%以上の収率、92%のエナンチオ選択性、2:98のジアステレオ選択性で触媒することができた。[6]さらなる利点として、BM3-Hstarは大気中の酸素（O2）の存在下で所望のシクロプロパン化反応を実行することもできた（これが可能な唯一の既知のBM3変異体）。[6]

図2. BM3-Hstar触媒による1とエチルジアゾ酢酸（EDA）の反応

CYP125

P450酵素は合成的有用性以外にも、生化学をより深く理解するために改変されてきた。[10]提案されている触媒サイクルに基づくと、軸方向に配位したチオレート部分（システイン）が金属中心に電子密度を供与し、鉄ペルオキソアニオン中間体（− OO-Fe 3+）のプロトン化を促進し、水分が失われるとCH結合反応性の鉄オキソ種（O = Fe 4+）が生成される。[2] [5] [8] [10]あるいは、鉄ペルオキソアニオンがプロトン化されないままである場合、この反応性種はアルデヒド含有基質のCC結合切断（脱ホルミル化）を媒介することができる。[10]鉄ペルオキソアニオンと鉄オキソ種間の中間二分性をより深く理解するために、コレステロール分解を含む様々な代謝過程を担うCYP125の軸配位システイン残基をセレノシステイン（SeCYP125）に置換するように改変した。その結果、SeCYP125はコレステロール-26-アルデヒドと反応した際に、脱ホルミル化物よりも酸化生成物の形成を促進することが観察された。これは、システインに対するセレノシステインからの電子供与の増加が、鉄ペルオキソアニオンに対する鉄オキソの割合の増加につながることを示唆している（図3）。[10]

図3. CYP125の触媒サイクルにおける鉄ペルオキソアニオンに対する軸配位子効果の比較

Ir(Me)-CYP119-Max

2016年にDydioらが発表した研究は、活性/非活性CH結合への分子内/分子間カルベンCH挿入を触媒する人工金属酵素を報告した（図4）。この触媒は、耐熱性P450酵素CYP119A1の鉄プロトポルフィリン補因子をイリジウムメチルプロトポルフィリン補因子（Ir(Me)-PIX）に置換し、その後、定向進化させることで開発された。その後、四重変異体（C317G、T213G、L69V、V254L）であるCYP119-Maxが得られた。触媒量を0.17 mol %に固定することで、最大±98%のエナンチオマー過剰率（ee）が得られた。 CYP119-Maxは分子間挿入反応も起こしますが、その効率は中程度（68%）です。CYP119-Maxのファインケミカル製造への応用可能性を示すため、200 mMスケールの反応でエチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-3-カルボキシレートを44%の収率、35,000回転数（TON）、93%の効率で生成しました。[7]

図4.金属酵素CYP119 Ir(Me)-PIX-CYP119変異体によって触媒される反応

参考文献

  1. ^ ブランニガン、ジェームズ；ウィルキンソン、アンソニー（2002年12月）「タンパク質工学20周年」Nature Reviews Molecular Cell Biology 3 (12 ) : 964–70 . doi :10.1038/nrm975. PMID  12461562. S2CID  1591624.
  2. ^ abcde McIntosh, John; Farwell, Christopher; Arnold, Frances (2014年3月20日). 「進化と工学によるP450触媒反応空間の拡大」Current Opinion in Chemical Biology . 19 : 126–134 . doi :10.1016/j.cbpa.2014.02.001. PMC 4008644. PMID  24658056 . 
  3. ^ Munro, Andrew; Girvan, Hazel; McLean, Kirsty (2006年12月15日). 「(t)hemeのバリエーション：シトクロムP450スーパーファミリーにおける新規メカニズム、酸化還元パートナー、および触媒機能」. Natural Product Reports . 24 (3): 585– 609. doi :10.1039/B604190F. PMID  17534532.
  4. ^ abcd Jung, Sang; Lauchli, Ryan; Arnold, Frances (2011年3月14日). 「シトクロムP450：野生型酵素の抑制」Current Opinion in Biotechnology . 22 (6): 809– 817. doi :10.1016/j.copbio.2011.02.008. PMC 3118264 . PMID  21411308. 
  5. ^ abcdefghi Fasan, Rudi (2012年2月22日). 「酸化触媒としてのP450酵素の調整」ACS Catalysis . 2 (4): 647– 666. doi :10.1021/cs300001x. S2CID  4674699.
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  7. ^ ab Dydio, P.; Key, H.; Nazarenko, A.; Rha, J.; Seyedkazemi, V.; Clark, D.; Hartwig, John (2016年10月7日). 「天然酵素の動態を持つ人工金属酵素」. Science . 354 (6308): 102– 106. Bibcode :2016Sci...354..102D. doi : 10.1126/science.aah4427 . PMC 11864347. PMID  27846500 . 
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  9. ^ van Agtmael, Michiel; Eggelte, Teunis; van Boxtel, Chris (1999年5月1日). 「マラリア治療におけるアルテミシニン系薬剤：薬草から登録医薬品へ」. Trends in Pharmacological Sciences . 20 (5): 199– 205. doi :10.1016/S0165-6147(99)01302-4. PMID  10354615.
  10. ^ abcde シバラマクリシュナン、サントシュ;ウエレット、ヒューグ。松村博敏；グアン、シェンヘン。ロコズ、ピエール。バーリンゲーム、アルマ。ポール・モンテラーノ（2012年3月23日）。 「近位リガンドの電子供与とシトクロム P450 鉄ペロキソ アニオンの反応性」。アメリカ化学会誌。134 (15): 6673–6684。土井:10.1021/ja211499q。PMC 3329582。PMID  22444582。 
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