G -lessカセット転写アッセイは、分子生物学においてin vitroでのプロモーター強度を決定するために用いられる手法です。この手法では、プラスミドを用いてmRNA産物を定量します。[1] G-lessカセットは、あらかじめ構築されたベクターの一部であり、通常、カセットの上流にマルチクローニングサイト（MCS）が含まれています。そのため、目的のプロモーターをMCSに直接挿入することで、転写機構のリクルートにおけるプロモーターの精度と効率を最終的に測定することができます。
G-lessカセットプラスミドにクローニングされます。
(a) 365塩基のG-lessセンス鎖を持つ既製のプラスミドにプロモーターを挿入します。(b)プロモーターは転写開始点のすぐ上流にあるマルチクローニングサイト（MCS）にクローニングされます。ポリメラーゼを用いてG-lessカセットを転写します。カセットが転写され、カセットの先のセンス鎖に最初のグアノシン三リン酸が検出されると、転写は途中で終結します。放射性標識された365塩基の転写産物が放出されます。G-lessカセットアッセイで生成された転写産物は、ゲル電気泳動で長さを確認し、オートラジオグラフィーで相対的なプロモーター強度を決定します。
方法
G-lessカセットは、DNAのセンス鎖にグアニンヌクレオチドが欠落した転写産物（したがって「 G -less」）をコードするレポーター遺伝子である。[2]このような遺伝子を含むプラスミドは、MCSの下流に位置する。プロモーターがMCSに挿入されると、放射標識UTP、CTP、ATP（および非放射標識／コールドヌクレオチド）の添加により転写が進行し、G-lessカセットの末端に達してDNAのセンス鎖にグアニン残基が再び現れるまで転写が継続する。in vitroにおいてGTPが存在しないと、カセットに続くセンス鎖の最初のグアニン残基で転写が途中で終結する。転写産物に対してゲル電気泳動を行い、オートラジオグラフィーまたはリン光イメージングによって放射活性量を定量することで、目的のプロモーターの強度を決定する。
応用
G-lessカセット法は、転写の基底レベルを超えたレベル（すなわち、転写活性化因子または転写因子[3]の存在下）におけるプロモーター強度を決定するために使用されます。例えば、TFIID存在下におけるサッカロミセス・セレビシエにおけるTATAボックス コンセンサス配列改変の影響を測定するために、G-lessカセットを用いて各プロモーターの相対的な強度を測定しました[4] 。
利点
G-lessアッセイは、環状プラスミドを用いて転写レベルを測定するために実施できます。環状プラスミドは、切断末端を必要とするランオフ転写などの他のアッセイと比較して、多くのシステムにおいてより効率的なテンプレートを提供します。この方法は、他の間接的なmRNA産物測定を行うという不要なプロセスを回避できるため、放射性標識転写産物を非常に効率的に生成します。プロモーターは、G-lessカセットを含む環状プラスミドに挿入され、プラスミド全体にわたるランダムかつ非特異的な転写を省略した特定の長さの転写産物を生成します。HeLa核抽出物などの粗精製システムの多くは、バックグラウンド転写につながるGTPの混入量が少なく、G-lessカセットを読み取ってランダムな転写を引き起こす可能性があるため、使用されます。[5]
参考文献
- ^ Park, JH; Magan, N (2014-11-12). 「クロマチンアセンブルp21プロモーターにおける無細胞転写の逆転写酵素結合定量的リアルタイムPCR解析」. PLOS ONE . 6 (8) e23617. doi : 10.1371/journal.pone.0023617 . PMC 3160311 . PMID 21886803.
- ^ アリア・バニアマド (2002). 甲状腺ホルモン受容体：方法とプロトコル. シュプリンガー・サイエンス＆ビジネス・メディア. p. 211. ISBN 978-1-59259-174-9。
- ^ Kazerouninia, A; Ngo, B; Martinson, HG (2014-11-12). 「ポリ(A)シグナル依存性の未処理新生転写産物の分解は、in vitroにおけるポリ(A)シグナル依存性転写停止を伴う」. RNA . 16 (1): 197– 210. doi :10.1261/rna.1622010. PMC 2802029. PMID 19926725 .
- ^ Bjornsdottir, G; Myers, LC (2014-11-12). 「RNAポリメラーゼII転写装置の最小構成要素がコンセンサスTATAボックスを決定する」Nucleic Acids Res . 36 (9): 2906–16 . doi :10.1093/nar/gkn130. PMC 2396422 . PMID 18385157.
- ^ Carey, MF; Peterson, CL; Smale, ST (2014-11-12). 「HeLa細胞核抽出物を用いたG-lessカセットin vitro転写」Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (3) pdb.prot5387. doi :10.1101/pdb.prot5387. PMID 20194456.
