| ハチェット | |
|---|---|
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| 識別子 | |
| シンボル | ハチェット |
| Rfam | RF02678 |
| その他のデータ | |
| RNA型 | 遺伝子;リボザイム |
| 行く | GO:0003824 |
| それで | SO:0000374 |
| PDB構造 | PDBe |
ハチェットリボザイムは、特定の部位で自身の切断を触媒するRNA構造です。言い換えれば、自己切断型リボザイムです。ハチェットリボザイムは、バイオインフォマティクス戦略[1]によって、ツイスターリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムに関連する遺伝子に関連するRNA（RAGATH）として発見されました。
その後の生化学分析によりリボザイムの機能の結論が裏付けられ、リボザイムによって触媒される化学反応のさらなる特徴が決定された。[2]
核酸分解リボザイムは、部位特異的な切断/連結反応が可能なコンパクトな折り畳み構造を採用した小さな RNA です。比較配列および構造アルゴリズムの適用に基づいて特定された、最近発見されたツイスター、ピストル、ツイスターシスター、およびハチェット リボザイムを含め、これまでに 14 種類の固有の核酸分解リボザイムが特定されています。
このクラスのコンセンサス配列と二次構造は、4つの塩基対構造を繋ぐバルジの間に散在する、高度に保存された13個のヌクレオチドと、その他の中程度に保存された多数のヌクレオチドから構成されています。代表的なハチェットリボザイムは、RNA鎖切断を促進するためにMg 2+などの二価カチオンを必要とし、最大速度定数は約4/分です。これまでに発見された他のすべての小型自己切断型リボザイムと同様に、ハチェットリボザイムは、リボースの2'-酸素原子による隣接リン中心への求核攻撃からなる一般的な触媒機構を採用しています。反応の速度論的特性は、このリボザイムクラスのメンバーが二価金属カチオンを必須要件としており、内部リン酸エステル転移によってRNA切断を促進するための複数の触媒戦略を採用する複雑な活性部位を有することを示しています。[3]
機構
ハチェットリボザイムのような核酸分解性リボザイムは、部位特異的なリン酸ジエステル結合の切断をもたらすSN2様機構を採用している。切断可能なリン酸の5 '末端にあるリボースの活性化2 ' -OH基は、切断される隣接するP-O5 'リン酸ジエステル結合を標的としてインラインアラインメントを形成し、その結果、2 ' ,3 '-環状リン酸と5 ' -OH基が形成される。ハンマーヘッド、ヘアピン、GlmS、デルタ肝炎ウイルス（HDV）、Varkudサテライト、ピストルリボザイムのX線結晶構造解析研究により、RNAフォールド全体、触媒ポケットの配置、インラインアラインメント、および切断反応に寄与する主要な残基が明らかにされている。切断部位は、コンセンサス二次モチーフの5'末端に位置する。[4]
さらに、求核性ヒドロキシル基の除去により、リボザイムは切断部位を形成できなくなるため不活性になります。より具体的には、2'-リボースまたは2'-OH基が2'-デオキシリボースまたは2'-H基に置換されると、隣接するリン酸基への求核攻撃を行うための電子が利用できなくなります。その結果、リン酸エステル結合が形成されなくなり、リボザイムの酵素切断能が再び不活性化されます。
二次構造
2019年、研究者らはハチェットリボザイムの2.1Åの生成物を結晶化しました。コンセンサス配列は右の図に示されています。ほとんどのハチェットリボザイムおよび一般的なリボザイムはP0配置を採用しています。P0は切断部位の5'末端に位置する追加のヘアピンループですが、高速触媒活性を促進するP1（5'末端）付近の短いコンセンサス配列を持つハンマーヘッドリボザイムとは異なり、触媒活性や機能には寄与しません。配列の約90%は保存されており、このクラスの他のリボザイムと類似しています。[1]
RNA 配列に基づいて、最終的に Hatchet リボザイムをコードする DNA 配列は、DNA 内のウラシルがチミンに置き換えられるため、5' から 3' まで次のようになります。
TTAGCAAGAATGACTATAGTCACTG TTTGTACACCCCGAATAGATTAGAA GCCTAATCATAATCACGTCTGCAAT TTTGGTACA
この配列構造のため、自己触媒切断後、RNAの3'末端の上流に8ヌクレオチド残基が残ります。[5]
三次構造
各リボザイムは異なるモチーフを持ち、したがって異なる三次構造を持ちます。
HT-UUCG をモチーフにした Hatchet リボザイムの三次構造は二量体形成によって形成される。二量体は、HT-GAAA の二量体形成産物と平衡状態にある対合鎖の 3' 末端の交換によって形成される。したがって、RNA 配列は単量体と二量体の構成間をシフトする。リボザイムの 3D 形状については、図 S1A および B を参照。[4] HT-GAAA リボザイムの 2 つの分子は、リボザイムの両方の単量体が比較的明確な電子密度を示す擬似対称二量体を実際に形成することができる。三次フォールドは 4 つのステム部分構造で構成され、これらは互いに共有結合して積み重ねられ、それぞれ P1、P2、P3、P4、L1、L2、L3 と呼ばれるらせん構造とループ構造を形成する（ただし、上の図には示されていない）。実際の切断部位は、P1とP2の接合部の間、P3とL2に隣接して位置しています。P1は天然状態では3塩基対または6塩基対で構成されており、それぞれ約40%と60%の割合で構成されていることから、長さが触媒機能に対応していることが示唆されます。[3]
また、塩基 U70' と A67' の間には保存された回文配列があり、これがワトソン・クリック塩基対相互作用 により二量体の形成を引き起こすと考えられます。
三次構造は、ループ間の相互作用に基づいて、それ自体の中にも長距離的な影響を持つ。[4]
pHとMgの影響2歳以上
リボザイム触媒実験は、MgCl 2を添加して行い、尿素と EDTA を含む停止溶液を添加して各時点で測定を停止しました。
pH 7.5で測定したk obs 値を、Mg 2+濃度の増加とともにプロットしたグラフ。リボザイム機能は急激に増加し、濃度が10 mMに近づくと横ばい状態になる。低Mg 2+濃度で観察される急勾配は、リボザイム活性を最大化するには、RNAごとに複数の金属イオンが必要であることを示唆している。さらに、このことは、Mg 2+を補因子として完全に飽和させるには、通常の生理学的濃度よりも高いMg 2+濃度が必要であることを示唆している。P0も含む天然の単分子構造は、通常の生理学的濃度に近い Mg 2+濃度で飽和に達する可能性がある。
10 mM Mg 2+を含む反応におけるpHがリボザイムの速度定数に及ぼす影響も実験的に測定された。pH依存的なリボザイム活性は、ミカエリス・メンテンプロットのk obs がpH値7.5付近で約4/分に達するまで、傾き1で直線的に増加する。これより高いpHでも同様な触媒効果が得られ、酸性度が増すとリボザイムが変性し始め、触媒機能が低下する。pH依存性と最大速度定数は、このリボザイムクラスが用いる可能性のある触媒戦略にとって興味深い示唆を与える。[3]
様々な一価および二価金属イオンがハチェットリボザイムの活性に及ぼす影響
Hatchetリボザイムコンストラクトは、 1 M（Na +、K +、Rb +、Li +、Cs +）、2.5 M（ Na + 、 K +）、または3 M（Li + ）の濃度で、他の一価カチオンのみを含む反応において、Mg 2+ の非存在下でインキュベートすると完全に不活性のままです。一方、Mn 2+、Co 2+、Zn 2+、Cd 2+などの他の二価金属イオンは、様々な効率でリボザイムの機能をサポートします。さらに、2つの金属イオン（Zn 2+、Cd 2+）は低濃度でのみ機能し、3つの金属イオン（Ba 2+、Ni 2+、Cu 2+ ）は、Mg 2+が存在する場合でも、0.5 mMで活性を阻害します。これらの結果は、ハチェットリボザイムが触媒作用を促進するために陽イオンを利用する範囲が比較的限定的であることを示しており、おそらくRNA構造内、あるいは活性部位に、限られた数の二価陽イオンを収容する1つ以上の特殊な結合部位が存在することを示唆していると考えられます。特定の二価金属イオンによる阻害は、重要なMg 2+イオンの置換、あるいはRNAフォールディングの全体的な破壊に起因する可能性があります。[3]
意義/応用
標準的な応用例の一つは、隣接する自己切断型リボザイムを用いて、機能性RNA分子（ shRNA、saiRNA、sgRNAなど）の正確な切り出し配列を生成することです。これは、遺伝子編集システム（ CRISPR / Cas sgRNAなど）や阻害システムの生体内発現に特に有用です。 [6]
もう一つの方法は、 siRNAのin vivo転写です。この設計では、複数の自己切断型リボザイムが用いられ、これらはすべて同じ遺伝子から転写されます。切断後、前駆体siRNAの両部分（siRNA 1と2）は二本鎖を形成し、意図したとおりに機能します。セットアップについては、siRNAの図[7]を参照してください。
最後に、自己切断型リボザイムをタンパク質配列と組み合わせる場合、リボザイムの自己切断機構がmRNAを修飾することを理解しておくことが重要です。5'リボザイムはpre-mRNAの下流5'末端を修飾し、細胞が5'キャップを形成できないようにします。これによりpre-mRNAの安定性が低下し、完全に機能する成熟mRNAになることが阻害されます。一方、3'リボザイムは上流pre-mRNAのポリアデニル化を阻害し、これもまた安定性を低下させ、成熟を阻害します。どちらも翻訳を阻害します。[5]
参考文献
- ^ ab Weinberg Z, Kim PB, Chen TH, Li S, Harris KA, Lünse CE, Breaker RR (2015). 「比較ゲノミクス解析により明らかになった自己切断型リボザイムの新クラス」Nat. Chem. Biol . 11 (8): 606–10 . doi :10.1038/nchembio.1846. PMC 4509812. PMID 26167874 .
- ^ Li S, Lünse CE, Harris KA, Breaker RR (2015). 「ハチェット自己切断リボザイムの生化学分析」. RNA . 21 (11): 1845–51 . doi :10.1261/rna.052522.115. PMC 4604424. PMID 26385510 .
- ^ abcd Li, Sanshu; Lünse, Christina E.; Harris, Kimberly A.; Breaker, Ronald R. (2015年11月). 「ハチェット自己切断リボザイムの生化学分析」. RNA . 21 (11): 1845– 1851. doi :10.1261/rna.052522.115. ISSN 1355-8382. PMC 4604424. PMID 26385510 .
- ^ abc Zheng, Luqian; Falschlunger, Christoph; Huang, Kaiyi; Mairhofer, Elisabeth; Yuan, Shuguang; Wang, Juncheng; Patel, Dinshaw J.; Micura, Ronald; Ren, Aiming (2019-05-14). 「Hatchetリボザイムの構造と切断機構への影響」. Proceedings of the National Academy of Sciences . 116 (22): 10783– 10791. Bibcode :2019PNAS..11610783Z. doi : 10.1073/pnas.1902413116 . ISSN 0027-8424. PMC 6561176. PMID 31088965 .
- ^ ab "Team:Hamburg/Contribution - 2020.igem.org". 2020.igem.org . 2021年11月24日閲覧。
- ^ Gao, Yangbin; Zhao, Yunde (2014年4月). 「CRISPRを介したゲノム編集のためのin vitroおよびin vivoにおけるリボザイム隣接RNAのガイドRNAへの自己プロセシング」. Journal of Integrative Plant Biology . 56 (4): 343– 349. Bibcode :2014JIPB...56..343G. doi : 10.1111/jipb.12152 . ISSN 1672-9072. PMID 24373158.
- ^ “Content”. labs.biology.ucsd.edu . 2021年11月24日閲覧。
