酵素反応速度論

大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素。その活性部位には、2つの基質であるジヒドロ葉酸（右）とNADPH（左）が結合している。タンパク質はリボン図で示されており、αヘリックス（赤）、βシース（黄色）、ループ（青）で示されている。（PDB : 7DFR）

酵素反応速度論は、酵素触媒による化学反応の速度を研究する学問です。酵素反応速度論では、反応速度を測定し、反応条件を変化させた場合の影響を調べます。このように酵素の反応速度論を研究することで、酵素の触媒機構、代謝における役割、酵素活性の制御方法、そして薬剤や修飾因子（阻害剤または活性化剤）が反応速度にどのように影響するかを明らかにすることができます。

酵素（E）は、生体触媒として働き、体内の化学反応を促進・加速させるタンパク質分子です。酵素は、別の分子である基質（S）と結合することで、目的の生成物を生成します。基質は酵素の活性部位に結合し、酵素基質複合体ESを形成します。そして、酵素基質複合体EPへと変換され、さらに遷移状態ES*を経て生成物Pへと変換されます。この一連のステップは、メカニズムとして知られています。

E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

ジヒドロ葉酸還元酵素のように、酵素が複数の基質に結合する場合、酵素反応速度論は、これらの基質が結合する順序と、生成物が放出される順序を示すこともできます。単一の基質に結合して複数の生成物を放出する酵素の例としては、1つのタンパク質基質を2つのポリペプチド生成物に切断するプロテアーゼがあります。また、ヌクレオチドをDNAに結合させるDNAポリメラーゼのように、2つの基質を結合する酵素もあります。これらのメカニズムは複雑な一連のステップで構成されることが多いですが、通常は全体の反応速度論を決定する1つの律速段階が存在します。この律速段階は、酵素または基質の化学反応または構造変化（酵素からの生成物の放出に関与するものなど）である可能性があります。

酵素の構造に関する知識は、反応速度論的データの解釈に役立ちます。例えば、構造は、触媒反応中に基質と生成物がどのように結合するか、反応中にどのような変化が起こるか、さらには特定のアミノ酸残基が反応機構においてどのような役割を果たすかを示唆します。酵素によっては、反応機構の過程で大きく形状が変化するものがあり、そのような場合、酵素反応を起こさない基質類似体が結合している状態と結合していない状態の酵素構造を決定することが有用です。

生物学的触媒はすべてタンパク質酵素というわけではありません。リボザイムやリボソームなどのRNAベースの触媒は、 RNAスプライシングや翻訳など、多くの細胞機能に不可欠です。リボザイムと酵素の主な違いは、RNA触媒がヌクレオチドで構成されているのに対し、酵素はアミノ酸で構成されていることです。リボザイムもより限定された反応群を行いますが、その反応機構と速度論はリボザイムと同様の方法で分析・分類することができます。

一般原則

反応に添加される基質の量が増えると、利用可能な酵素結合部位はの限界まで満たされます。この限界を超えると、酵素は基質で飽和し、反応速度の増加は止まります。${\displaystyle V_{\max}}$

酵素触媒反応では、無触媒反応と全く同じ反応物が使用され、全く同じ生成物が生成される。他の触媒と同様に、酵素は基質と生成物の平衡位置を変化させない。^{[ 1 ]}しかし、無触媒化学反応とは異なり、酵素触媒反応は飽和速度論を示す。与えられた酵素濃度および比較的低い基質濃度では、反応速度は基質濃度とともに直線的に増加する。酵素分子は大部分が自由に反応を触媒し、基質濃度の増加は酵素と基質分子が互いに遭遇する速度の増加を意味する。しかし、比較的高い基質濃度では、反応速度は漸近的に理論上の最大値に近づく。酵素の活性部位は基質によってほぼすべて占有されて飽和し、反応速度は酵素の固有の回転速度によって決まる。^{[ 2 ]}これら 2 つの極限の場合の中間の基質濃度はK _Mで表される。したがって、KM_は反応速度が最大速度の半分になる基質濃度である。^{[ 2 ]}

酵素反応速度論における2つの重要な特性は、酵素が基質によってどれだけ容易に飽和するか、そして酵素が達成できる最大速度です。これらの特性を知ることで、酵素が細胞内でどのような働きをするかを推測でき、また、酵素がこれらの条件の変化にどのように反応するかを知ることができます。^{[ 3 ]}

酵素アッセイ

酵素反応の進行曲線。初期速度期における傾きは、反応の初期速度vです。ミカエリス・メンテンの式は、この傾きが基質濃度によってどのように変化するかを記述します。

酵素アッセイは、酵素反応の速度を測定する実験手順です。酵素は触媒する反応によって消費されないため、酵素アッセイでは通常、基質または生成物の濃度変化を追跡することで反応速度を測定します。測定方法は数多くあります。分光光度アッセイは、生成物と反応物間の吸光度の変化を観察します。放射光アッセイは、放射能の取り込みまたは放出を利用して、時間の経過に伴う生成物の量を測定します。分光光度アッセイは、反応速度を連続的に測定できるため、最も簡便です。放射光アッセイはサンプルの採取と計数を必要とする（つまり、不連続アッセイである）ものの、通常は非常に感度が高く、非常に低レベルの酵素活性を測定することができます。^{[ 4 ]}類似のアプローチとして、質量分析 法を用いて、基質が生成物に変換される際の安定同位体の取り込みまたは放出をモニタリングする方法があります。アッセイが失敗することもあり、失敗したアッセイを復活させるためのアプローチが不可欠です。^{[ 5 ]}

最も感度の高い酵素アッセイでは、顕微鏡を通してレーザーを集光し、単一酵素分子が反応を触媒する際の変化を観察する。これらの測定では、酵素の反応機構における補因子の蛍光変化、またはタンパク質の特定部位に添加された蛍光色素の変化を用いて、触媒反応中に生じる動きを報告する。^{[ 6 ]}これらの研究は、数百万個の酵素分子の集団の平均的な挙動を観察する従来の酵素反応速度論とは対照的に、単一酵素の反応速度論と動態に関する新たな視点を提供する。^{[ 7 ] [ 8 ]}

酵素アッセイの反応進行曲線の例を上に示す。酵素は、反応開始後しばらくの間、ほぼ直線的な初期速度で生成物を生成する。反応が進行し、基質が消費されるにつれて、反応速度は継続的に低下する（基質が飽和レベルに達していない限り）。初期（および最大）速度を測定するために、酵素アッセイは通常、反応が完全完了に向かってわずか数パーセントしか進行していない間に行われる。初期速度測定期間の長さはアッセイ条件に依存し、数ミリ秒から数時間までの範囲となる。しかし、液体を急速に混合する装置を用いることで、1秒未満の初期速度で迅速な反応速度測定が可能となる。^{[ 9 ]}このような非常に迅速なアッセイは、定常状態前の反応速度を測定するために不可欠である。^{[ 10 ]}

ほとんどの酵素反応速度論研究は、酵素反応のこの初期の、ほぼ線形な部分に焦点を当てています。しかし、完全な反応曲線を測定し、そのデータを非線形速度式に当てはめることも可能です。この酵素反応の測定方法は、プログレスカーブ解析と呼ばれます。このアプローチは、初期反応速度が速すぎて正確に測定できない場合に、急速反応速度論の代替として有用です。^{[ 11 ]}

酵素学データ報告基準ガイドラインは、酵素活性に関する研究から得られた反応速度論的および平衡論的データを、対応する実験条件を含めて包括的に報告するために必要な最小限の情報を提供する。このガイドラインは、酵素機能データを厳密かつ堅牢に報告するために策定された。^{[ 12 ]}

単一基質反応

単一基質反応機構を持つ酵素には、トリオースリン酸イソメラーゼやビスホスホグリセリン酸ムターゼなどのイソメラーゼ、アデニル酸シクラーゼなどの分子内リアーゼ、RNAリアーゼであるハンマーヘッドリボザイムなどがある。[ 13 ^{]しかし、}単一基質しか持たない酵素の中には、このカテゴリーの機構には当てはまらないものもある。カタラーゼがその一例で、この酵素は最初の過酸化水素分子と反応し、酸化され、次に2番目の基質分子によって還元される。単一の基質が関与しているが、修飾された酵素中間体の存在は、カタラーゼの機構が実際にはピンポン機構であることを意味しており^{[ 14 ]} 、これは以下の複数基質反応のセクションで説明するタイプの機構である。

ミカエリス・メンテン反応速度論

酵素触媒の有無にかかわらず、化学反応機構。酵素（E）が基質（S）に結合して生成物（P）を生成します。

酵素反応の飽和曲線。基質濃度と反応速度の関係を示しています。

酵素触媒反応は飽和性であるため、触媒速度は基質の増加に対して直線的な応答を示さない。反応の初期速度を基質濃度（[S]と表記）の範囲で測定すると、初期反応速度（）は[S]の増加に伴って増加する。しかし、[S]が高くなると、酵素は基質で飽和し、初期速度は酵素の最大速度であるV _{maxに達する。} ^{[ 15 ]}${\displaystyle v_{0}}$

単一基質反応のミカエリス・メンテン反応速度論モデルでは、酵素 E と基質 S の間で最初の二分子反応が起こり、酵素・基質複合体 ES が形成されます。酵素反応の速度は、基質濃度が V _maxと呼ばれる特定のレベルまで増加するにつれて増加します。V _maxでは、基質 (S) と反応できる酵素 (E) がもう存在しないため、基質濃度が増加しても反応速度は増加しません。ここで、反応速度は ES 複合体に依存するようになり、反応はゼロ次の単分子反応になります。単分子反応の酵素機構は非常に複雑になる可能性がありますが、通常は 1 つの律速酵素ステップがあり、これによりこの反応は見かけの単分子速度定数k _catを持つ単一の触媒ステップとしてモデル化できます。反応経路が1つまたは複数の中間体を経由する場合、k _{cat は}複数の基本反応速度定数の関数となるが、最も単純な単一の基本反応（例えば中間体なし）の場合、k cat は基本単分子反応速度定数k ₂と同一となる。見かけの単分子反応速度定数k _catはターンオーバー数とも呼ばれ、1秒間に触媒される酵素反応の最大数を表す。^{[ 16 ]}${\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}}$

ミカエリス・メンテン式^{[ 17 ]}_は、（初期）反応速度v0が基質結合平衡の位置と速度定数k2にどのように依存_するかを記述している。^{[ 18 ]}

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$     （ミカエリス・メンテン方程式）

定数で

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

このミカエリス・メンテンの式は、ほとんどの単一基質酵素反応速度論の基礎となる。この式には、2つの重要な仮定が根底にある（中間体や生成物の阻害は存在せず、アロステリック性や協同性もないという一般的な仮定とは別に）。最初の仮定は、いわゆる準定常状態仮定（または擬似定常状態仮説）であり、基質に結合した酵素（そして結合していない酵素も）の濃度は、生成物や基質の濃度よりもはるかにゆっくりと変化するため、複合体の経時変化はゼロとすることができるというものである。^{[ 19 ]}

${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$ 。

2つ目の仮定は、総酵素濃度は時間とともに変化しないということであり、したがって

${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$ 。

ミカエリス定数K _Mは、酵素反応速度がV _{max の半分になる濃度として実験的に定義され、ミカエリス・メンテン式に[S] =} K _Mを代入することで検証でき、グラフでも確認できます。もし、律速酵素反応が基質解離（）に比べて遅い場合、ミカエリス定数K _MはES複合体の解離定数K _Dとほぼ等しくなります。 ^{[ 20 ]}が に比べて小さい 場合、項 となり、ES複合体もほとんど形成されないため となります。したがって、生成物形成速度は ${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$ ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$ ${\displaystyle K_{M}}$ ${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\おおよそ [{\ce {S}}]/K_{M}}$ ${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\about [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

このように、生成物の形成速度は、基質濃度だけでなく酵素濃度にも依存するため、式は、対応する擬似二次反応速度定数 を持つ二分子反応に似ています。この定数は触媒効率の尺度です。最も効率的な酵素は、10 ⁸ – 10 ¹⁰ M ⁻¹ s ⁻¹の範囲で に達します。これらの酵素は非常に効率的であるため、基質分子に遭遇するたびに効果的に反応を触媒し、効率の理論上の上限（拡散限界）に達しています。そのため、速度論的に完全な酵素と呼ばれることもあります。^{[ 21 ]}しかし、ほとんどの酵素は完璧にはほど遠く、との平均値はそれぞれ約 と です。^{[ 22 ]}${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$ ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$   ${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$ ${\displaystyle k_{2}}$ ${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$ ${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

ミカエリス・メンテン式の直接利用による時間経過速度論解析

ミカエリス・メンテン方程式によって予測される観測速度は、ミカエリス・メンテン方程式を一次化学反応速度論の式に組み込むことで、基質の消失と生成物の生成の時間経過を直接モデル化するために使用できます。ただし、これは一次化学反応速度論の記述においてオイラー数を使用することに伴う問題を認識した場合にのみ可能です。すなわち、 e ^{− k}は計算に系統的誤差をもたらす分割定数であり、各時間間隔後の残存基質を表す単一の定数として書き直すことができます。^{[ 23 ]}

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max}[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

1983年にスチュアート・ビール（および1997年にサンティアゴ・シュネルとクラウディオ・メンドーサも独立に）は、ミカエリス・メンテン機構の経時的反応速度論解析の閉形式の解を導出した。^{[ 24 ] [ 25 ]}シュネル・メンドーサ方程式として知られるこの解は、^{[ 26 ]}次のような形をしている。

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

ここでW[ ]はランバートW関数である。^{[ 27 ] [ 28 ]}そしてF(t)は

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

この式はベルベラン・サントスによって得られた以下の式に包含されており、この式は初期の基質濃度が酵素の濃度に近い場合にも有効である^{[ 29 ]。}

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

ここでW[ ]は再びLambert-W関数です。

ミカエリス・メンテン方程式の線形プロット

軸切片と勾配の重要性を示す、運動データのラインウィーバー・バークまたは二重逆数プロット。

上記のvと[S]の関係を示すグラフは直線ではありません。最初は低い[S]で直線ですが、高い[S]で飽和します。コンピュータによる非線形曲線フィッティングが普及する以前は、この非線形性のためにK _MとV _maxを正確に推定することが困難でした。そのため、複数の研究者がミカエリス–メンテン式の線形化、例えばLineweaver–Burkプロット、Eadie–Hofstee図、Hanes–Woolfプロットなどを考案しました。これらの線形表現はすべてデータの視覚化には役立ちますが、非線形回帰法を用いたより正確な決定を可能にするコンピュータソフトウェアが容易に入手できるため、運動学的パラメータの決定にはいずれも使用すべきではありません。^{[ 30 ]}

ラインウィーバー・バーク・プロット、あるいは二重逆数プロットは、運動学的データを示す一般的な方法です。これは、ミカエリス・メンテン式の両辺の逆数を取ることで作成されます。 ^{[ 31 ]}これはミカエリス・メンテン式の線形形式であり、 y = m x + cの直線を描きます。y切片は1 / V _maxに等しく、x切片は-1/ K _Mを表します。

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

負の 1/[S] では実験値を取得できません。下限値 1/[S] = 0（y切片）は無限大の基質濃度に対応し、1/v=1/V _maxとなるため、x切片は正の濃度で取得された実験データの外挿になります。より一般的には、Lineweaver–Burk プロットは低い基質濃度で取得された測定値の重要性を歪め、V _maxとK _Mの推定値が不正確になる可能性があります。^{[ 32 ]} より正確な線形プロット法はEadie–Hofstee プロットです。この場合、vはv /[S]に対してプロットされます。3 番目によく使用される線形表現であるHanes–Woolf プロットでは、[S]/ vは [S] に対してプロットされます。一般に、データの正規化は実験作業量を減らし、出力の信頼性を高めるのに役立ち、グラフ解析と数値解析の両方に適しています。^{[ 33 ]}

運動定数の実際的な意義

酵素反応速度論の研究は、2つの基本的な理由で重要である。第一に、酵素がどのように働くかを説明するのに役立つこと、そして第二に、生体内での酵素の挙動を予測するのに役立つことである。上で定義した反応速度定数K _MおよびV _maxは、酵素がどのように連携して代謝を制御するかを理解しようとする試みにおいて極めて重要である。^{[ 34 ]} こうした予測をすることは、単純なシステムであっても簡単ではない。例えば、オキサロ酢酸はミトコンドリア内でリンゴ酸脱水素酵素によって生成される。オキサロ酢酸はその後、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって消費され、それぞれクエン酸回路、糖新生、またはアスパラギン酸生合成に送られる。オキサロ酢酸がどの経路にどれだけ入るかを予測するには、オキサロ酢酸の濃度だけでなく、これらの酵素の濃度と反応速度論に関する知識も必要となる。代謝経路の挙動を予測するというこの目的は、膨大な量の運動学的および遺伝子発現データを生物全体の数理モデルに統合することで、最も複雑な表現に達する。あるいは、代謝モデリングの問題を簡略化する有用な方法の一つとして、基礎となる酵素の運動学的特性を無視し、反応ネットワークの化学量論に関する情報のみに頼る方法がある。この手法はフラックスバランス解析と呼ばれる。^{[ 35 ] [ 36 ]}

中間体を含むミカエリス・メンテン反応速度論

より単純なケースも考えられる。

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

酵素と中間体との複合体が存在し、中間体は第二段階で生成物に変換されます。この場合、非常によく似た式が成り立ちます^{[ 37 ]}

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}$

しかし定数は異なる

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

極限の場合、つまり からの最後のステップが前のステップよりもはるかに速い場合、元の方程式に戻ることがわかります。数学的には、 となり、 となります。^{[ 38 ]}${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$ ${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$ ${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$ ${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

多基質反応

多基質反応は、基質がどのように、どのような順序で結合するかを記述する複雑な反応速度式に従います。基質Aの濃度を一定に保ち、基質Bを変化させると、これらの反応の解析ははるかに簡単になります。これらの条件下では、酵素は単一基質酵素と同様に振舞い、[S]によるvのプロットは、基質Bの見かけのKMおよびVmax_{定数を与えます。}これらの測定を異なるA濃度で実施すれば、これらのデータを用いて反応機構を解明することができます。2つの基質AとBを取り込み、それらを2つの生成物PとQに変換する酵素には、三元複合体機構と置換酵素機構という2種類の機構があります。^{[ 39 ]}

三元複合体メカニズム^{[ 40 ]}

酵素反応におけるランダム順序三元複合体機構。反応経路は線で示され、その下に基質AとB、または生成物PとQを含む酵素中間体が記されている。

これらの酵素では、両方の基質が同時に酵素に結合し、EAB三元複合体を形成する。結合順序はランダム（ランダム機構）の場合もあれば、基質が特定の順序で結合しなければならない（順序機構）場合もある。三元複合体機構を持つ酵素のv ×[S]曲線（Aを固定、Bを変化させる）をラインウィーバー・バークプロットにプロットすると、生成される直線は交差する。^{[ 41 ]}

三元複合体機構を持つ酵素としては、グルタチオンS-トランスフェラーゼ^{[ 42 ]} 、ジヒドロ葉酸還元酵素^{[ 43 ]}、DNAポリメラーゼ^{[ 44 ]}などがある。

置換酵素（「ピンポン」）機構^{[ 45 ]}

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

酵素反応のピンポン機構。中間体には基質AとB、または生成物PとQが含まれます。

置換酵素機構を持つ酵素は、E と化学的に修飾された酵素 E* の 2 つの状態で存在できます。この修飾された酵素は中間体として知られています。このような機構では、基質 A が結合し、例えば活性部位に化学基を転移させることで酵素を E* に変化させ、その後放出されます。最初の基質が放出された後にのみ、基質 B が結合して修飾された酵素と反応し、修飾されていない E 型が再生されます。置換酵素機構を持つ酵素からのv x [S] 曲線のセット (A は固定、B は変化) を Lineweaver–Burk プロットにプロットすると、平行線のセットが生成されます。これは二次プロットと呼ばれます。^{[ 46 ] [ 47 ]}

置換酵素機構を持つ酵素には、チオレドキシンペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素^{[ 48 ]}、アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ^{[ 49 ]}などの転移酵素、トリプシンやキモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ^{[ 50 ]}などがある。 セリンプロテアーゼは非常に一般的で多様な酵素ファミリーであり、消化酵素（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）、血液凝固カスケードのいくつかの酵素などが含まれる。これらのセリンプロテアーゼにおいて、E*中間体は、タンパク質基質のペプチド結合上の活性部位のセリン残基の攻撃によって形成されるアシル酵素種である。^{[ 51 ]}

記憶効果

これら2種類のメカニズムはどちらも酵素記憶を示す可能性があるが、原因と結果はそれぞれ大きく異なる。三元複合体メカニズムでは、メカニズムに遅いプロセスが含まれており、結合ステップが準平衡状態にない場合に、中間体が非常に速く除去される可能性があるため、これが起こり得る。これにより、モノマー酵素であっても協同性が生じる可能性がある。 ^{[ 52 ]}置換酵素メカニズムでは、記憶効果を生成するために遅いステップは必要ない。その代わりに、複数の代替基質を持つ酵素の場合、同じ置換酵素が変換されているように見えても、後半の反応の速度論的特性は前半の反応の基質によって変化する可能性がある。^{[ 53 ]}

可逆触媒とハルデン方程式^{[ 54 ]}

外的要因は、酵素が両方向の反応を触媒する能力を制限する可能性がある（一方、微視的可逆性の原理によれば、触媒の性質自体が一方向のみを触媒することはできない）。^{[ 55 ]}両方向の反応を触媒する酵素の場合を考える。

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

定常状態における反応の初期速度は ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}$

${\displaystyle v_{0}}$ 反応が順方向（）に進む場合は正、そうでない場合は負になります。 ${\displaystyle S\rightarrow P}$

平衡には が必要であり、これは のときに起こります。これは、熱力学が4つの速度定数の値の間に関係を強制することを示しています。 ${\displaystyle v=0}$ ${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

、、、、についてそれぞれ得られた順 方向および 逆方向の最大速度の値は、 それぞれ およびである。これらの比は平衡定数と等しくなく、これは熱力学が最大速度の比を制約しないことを意味する。これは、酵素が反応の特定の方向において（最大速度の観点から）はるかに「優れた触媒」となり得ることを説明する。^{[ 56 ]}${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

から2つのミカエリス定数と を導くこともできます。ハルデン方程式は関係式です。 ${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$ ${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$ ${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

したがって、熱力学は値の比率ではなく、前方値と後方値の間の比率を制限します。 ${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

非ミカエリス・メンテン反応速度論

シグモイド動力学を示す酵素反応の飽和曲線。

多種多様な酵素系が非ミカエリス・メンテン挙動を示す。例としては、自己触媒酵素、協同的およびアロステリック酵素、界面および細胞内酵素、プロセッシブ酵素などの反応速度論が挙げられる。一部の酵素はシグモイドv ×[S]プロットを示すが、これは多くの場合、活性部位への基質の協同的結合を示す。これは、1つの基質分子の結合が後続の基質分子の結合に影響を及ぼすことを意味する。この挙動は、相互作用する複数の活性部位を持つ多量体酵素で最もよく見られる。^{[ 57 ]}ここで、協同のメカニズムはヘモグロビンのものと似ており、1つの活性部位への基質の結合が、基質分子に対する他の活性部位の親和性を変化させる。正の協同性は、最初の基質分子の結合が基質に対する他の活性部位の親和性を高めるときに生じる。負の協同性は、最初の基質の結合が酵素の他の基質分子に対する親和性を低下させるときに生じる。 ^{[ 58 ]} アロステリック酵素には、負の協同性を示す哺乳類チロシルtRNA合成酵素^{[ 59 ]} 、正の協同性を示す細菌アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ^{[ 60 ]}およびホスホフルクトキナーゼ^{[ 61 ]}が含まれる。 協同性は一般的であり、基質濃度の変化に対する酵素の応答を制御するのに役立つ。正の協同性は酵素を[S]に対してはるかに敏感にし、その活性は狭い範囲の基質濃度で大きな変化を示すことができる。逆に、負の協同性は酵素を[S]の小さな変化に対して鈍感にする。^{[ 62 ]}

ヒルの式^{[ 63 ]}は、非ミカエリス・メンテン反応速度論における協同性の度合いを定量的に記述するためによく用いられる。導出されるヒル係数nは、基質が一つの活性部位に結合することで、他の活性部位への基質の結合にどの程度影響するかを測定する。ヒル係数が1未満の場合、協同性は負であり、1を超える場合、協同性は正であることを示す。^{[ 64 ]}

前定常状態速度論

酵素反応のバースト段階を示す、定常状態前の進行曲線。

酵素が基質と混合された直後には、生成物も中間体も存在しません。反応のその後の数ミリ秒間の研究は、前定常状態速度論と呼ばれます。したがって、前定常状態速度論は、酵素-基質中間体（ESやE*など）が定常状態濃度に達するまでの生成と消費に着目します。^{[ 65 ]}

このアプローチは、キモトリプシンによって触媒される加水分解反応に初めて適用されました。^{[ 66 ]}酵素がどのような機構に従うかを調べる上で、中間体の検出はしばしば重要な証拠となります。例えば、上に示したピンポン機構では、迅速な速度論的測定によって生成物Pの放出を追跡し、修飾された酵素中間体E*の形成を測定することができます。^{[ 67 ]}キモトリプシンの場合、この中間体は活性部位の求核性セリンによる基質への攻撃とアシル酵素中間体の形成によって形成されます。^{[ 68 ]}

図では、酵素は反応開始後数秒間で急速にE*を生成する。その後、定常状態に達すると速度は低下する。この反応の急速なバースト期は、酵素の1回のターンオーバーを測定する。したがって、このバースト期に放出される生成物の量（グラフのy軸切片として示される）は、アッセイ中に存在する機能的な酵素の量も示す。^{[ 69 ]}

化学メカニズム

酵素反応速度論の測定における重要な目標は、酵素反応の化学的メカニズム、すなわち基質を生成物に変換する一連の化学反応過程を明らかにすることです。上述の速度論的アプローチは、中間体の生成速度と相互変換速度を明らかにしますが、これらの中間体が何であるかを正確に特定することはできません。^{[ 70 ]}

様々な溶液条件下で、あるいはわずかに改変した酵素や基質を用いて行われた速度論的測定は、反応における律速段階や中間体を明らかにするため、この化学機構の解明にしばしば役立つ。例えば、水素原子への共有結合の切断は、一般的な律速段階である。どの水素移動が律速段階であるかは、各水素をその安定同位体である重水素に置換したときの速度論的効果を測定することによって示すことができる。臨界水素が置換されると、一次的な同位体効果により速度が変化する。これは、重水素との結合は水素との結合よりも切断されにくいために生じる。^{[ 71 ] 13} C/ ¹² Cや¹⁸ O/ ¹⁶ Oなどの他の同位体置換でも同様の効果を測定することも可能であるが、これらの効果はより微妙である。^{[ 72 ]}

同位体は、最終生成物中の基質分子の様々な部分の運命を明らかにするためにも用いられる。例えば、最終生成物中の酸素原子の起源を特定することは、水由来か基質の一部由来かのどちらかであるため、困難な場合がある。これは、反応に関与する様々な分子に酸素の安定同位体^{18Oを系統的に置換し、生成物中の同位体を調べることで特定できる。 [ 73 ]}化学的メカニズムは、異なるpH条件下での反応速度論および同位体効果を調べること、^{[ 74 ]}金属イオンやその他の結合した補因子を変化させること、^{[ 75 ]}保存されたアミノ酸残基の部位特異的変異誘発 、あるいは基質類似体存在下での酵素の挙動を研究することによっても解明できる。^{[ 76 ]}

酵素阻害と活性化

可逆的酵素阻害剤の速度論的スキーム。

酵素阻害剤は酵素の活性を低下または阻害する分子であり、酵素活性化剤は酵素の触媒速度を高める分子である。これらの相互作用は可逆的（阻害剤を除去すると酵素活性が回復する）または不可逆的（阻害剤が酵素を永久に不活性化する）のいずれかである。^{[ 77 ]}

可逆的阻害剤

従来、可逆的な酵素阻害剤は、K _MおよびV _maxへの影響に応じて、競合的、非競合的、または非競合的に分類されてきました。これらの異なる影響は、阻害剤がそれぞれ酵素 E、酵素‐基質複合体 ES、またはその両方に結合することによって生じます。これらのクラスの分割は、それらの導出における問題から生じ、1 つの結合イベントに 2 つの異なる結合定数を使用する必要が生じます。阻害剤の結合と酵素活性に対するその影響は 2 つの明確に異なるものであり、従来の式では考慮されていないもう 1 つの問題です。非競合阻害では、阻害剤の結合によって酵素のみが 100% 阻害され、その中間の可能性は考慮されていません。^{[ 78 ]} 非競合阻害では、阻害剤は酵素のアロステリック部位に結合するため、基質と酵素の結合親和性、つまりK _Mの逆数は同じままです。一方、 V _{max は}阻害されていない酵素に比べて減少します。ラインウィーバー・バーク・プロットでは、非競合的阻害剤の存在は、1/V _{maxと定義される y 切片の変化によって示されます。-1/} K _Mと定義される x 切片は変化しません。競合阻害では、阻害剤は酵素の活性部位に結合し、基質と競合します。その結果、K _{M は}増加し、V _{max は}同じままになります。^{[ 79 ]}また、阻害項の一般的な形式は、阻害剤と酵素の結合と、ミカエリス・メンテン式やリガンド受容体結合に関連する用量反応曲線など、他の結合項との関係を不明瞭にします。^{[ 80 ]} この関係を示すために、次の並べ替えを行うことができます。

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

一番下にゼロを足す（[I]-[I]）

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

[I]+K _iで割る

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

この表記は、反応速度が基質と相互作用する酵素集団の割合に依存するミカエリス・メンテンの式と同様に、阻害剤の効果も阻害剤と相互作用する酵素集団の割合の結果であることを示しています。この式の現在の形の唯一の問題は、阻害剤の結合によって酵素が完全に阻害されると仮定していることです。実際には、基質のターンオーバーが100%阻害される場合から0%を超える場合まで、幅広い範囲で阻害効果が現れる可能性があります。^{[ 81 ]}これを考慮するために、式にデルタV _max項 を追加することで、阻害の程度を考慮できるように修正することができます。

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

または

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

この項は、阻害剤が集団内の個々の酵素と相互作用しているときに存在する残留酵素活性を定義することができます。しかし、この項を含めることで、二次的なVmax_項が最初の項よりも高い場合、活性化の可能性を考慮するという付加価値があります。^{[ 82 ]}活性化の可能性も考慮するために、阻害剤「I」を修飾項「X」に置き換えて表記を書き直すことができます。

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

この用語法は、ミカエリス・メンテン式の最高速度に関連する運動学的効果を扱う簡略化された方法となるが、K _Mに関連する効果を記述するために使用される用語の潜在的な問題を浮き彫りにする。酵素と基質の親和性に関連するK _{Mは、ほとんどの場合、酵素阻害剤との相互作用によって直接生じる酵素の結合部位の潜在的な変化に関連するはずである。したがって、上記で提案された}V _maxを調節するための用語と同様の用語は、ほとんどの場合に適切であるはずである。^{[ 83 ]}

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

不可逆的阻害剤

酵素阻害剤は、通常、活性部位残基を共有結合的に修飾することにより、酵素を不可逆的に不活性化する。自殺基質と呼ばれることもあるこれらの反応は、指数関数的減衰関数に従い、通常は飽和する。飽和状態未満では、阻害剤に対する一次速度論に従う。不可逆阻害は2つの異なるタイプに分類できる。アフィニティー標識は不可逆阻害の一種であり、反応性の高い官能基が標的タンパク質上の触媒的に重要な残基を修飾することで阻害を引き起こす。一方、メカニズムに基づく阻害は、阻害剤が結合した後、酵素を介した変化が起こり、阻害剤が反応性基に変換され、酵素を不可逆的に修飾する。^{[ 84 ]}

触媒のメカニズム

反応座標の関数としてのエネルギー変化は、酵素による遷移状態の安定化を示しています。

酵素‐基質相互作用の好ましいモデルは誘導適合モデルである。^{[ 85 ]}このモデルは、酵素と基質の間の初期の相互作用は比較的弱いが、これらの弱い相互作用が急速に酵素の構造変化を引き起こし、結合を強化すると提唱している。これらの構造変化により、活性部位の触媒残基も基質の化学結合に近づき、反応で変化してしまう。^{[ 86 ]}構造変化は円二色性または二重偏光干渉法を使用して測定できる。結合が起こった後、1つまたは複数の触媒機構が反応の代替化学経路を提供することで、反応の遷移状態のエネルギーを低下させる。触媒機構には、結合ひずみによる触媒、近接性と配向による触媒、活性部位のプロトン供与体または受容体による触媒、共有結合触媒、量子トンネル効果などがある。^{[ 67 ] [ 87 ]}酵素は量子トンネル効果によって水素転移反応を加速することができる。量子トンネル効果とは、陽子や電子などの粒子が波のような性質を持つため、エネルギー障壁を乗り越えるのではなく、エネルギー障壁を通過する現象である。^{[ 88 ]}

酵素反応速度論は、酵素がどのような触媒様式を用いているのかを証明することはできません。しかしながら、一部の反応速度論データは、他の手法で検証できる可能性を示唆することがあります。例えば、バースト期前定常状態反応速度論を伴うピンポン機構は、この酵素の反応機構において共有結合触媒が重要である可能性を示唆します。あるいは、V _{maxには強いpH効果があり、} K _Mには影響がないという観察結果は、触媒作用が生じるためには活性部位の残基が特定のイオン化状態にある必要があることを示唆している可能性があります。^{[ 89 ]}

歴史

1902年、ヴィクトル・アンリは酵素反応速度論の定量的理論を提唱したが^{[ 90 ]}、当時は水素イオン濃度の実験的意義はまだ認識されていなかった。1909年、ペーター・ラウリッツ・ソーレンセンが対数pHスケールを定義し、緩衝作用の概念を導入した後^{[ 91 ]}、ドイツの化学者レオノール・ミカエリスとモード・レオノーラ・メンテン博士（当時ミカエリスの研究室のポスドク研究員）はアンリの実験を繰り返し、彼の式を確認した。この式は現在、一般的にミカエリス・メンテン反応速度論（アンリ・ミカエリス・メンテン反応速度論とも呼ばれる）と呼ばれている。^{[ 92 ]}彼らの研究はGEブリッグスとJBSハルデンによってさらに発展させ、今日でも酵素活性のモデル化の出発点として広く考えられている反応速度論式を導出した。^{[ 93 ]}

アンリ・ミカエリス・メンテン理論の大きな貢献は、酵素反応を二段階に分けて考えたことである。^{[ 94 ]}第一段階では、基質が酵素に可逆的に結合し、酵素基質複合体を形成する。これはミカエリス複合体と呼ばれることもある。酵素は反応の化学反応段階を触媒し、生成物を放出する。多くの酵素の反応速度論は単純なミカエリス・メンテンモデルで十分に説明できるが、すべての酵素はモデルでは考慮されていない内部運動を持ち、全体的な反応速度論に大きく寄与する可能性がある。これは、変動速度と関連する複数のミカエリス・メンテン経路を導入することでモデル化できる。^{[ 95 ] [ 96 ] [ 97 ]}これは基本的なミカエリス・メンテン機構の数学的拡張である。^{[ 98 ]}

ソフトウェア

ENZO（Enzyme Kinetics）は、酵素触媒反応の速度論モデルを構築するためのグラフィカルインターフェースツールです。ENZOは、指定された酵素反応スキームから対応する微分方程式を自動的に生成します。これらの微分方程式は、数値ソルバーと回帰アルゴリズムによって処理され、微分方程式の係数を実験的に観測された時間経過曲線に当てはめます。ENZOは、競合する反応スキームを迅速に評価することを可能にし、酵素速度論の日常的な試験に使用できます。^{[ 99 ]}

参照

• タンパク質ダイナミクス
• 拡散律速酵素
• ラングミュア吸着モデル

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外部リンク

• 酵素— Expasy酵素命名データベース
• ENZO — 酵素触媒反応の速度論モデルを簡単に構築し、素早くテストするための Web アプリケーション。
• ExCatDB — 酵素触媒機構のデータベース
• BRENDA — 基質、阻害剤、反応図を含む包括的な酵素データベース