細胞活動を記録する光遺伝学的手法

オプトジェネティクスは、チャネルロドプシン等を用いて光によってニューロンの活動を変化させる手法から始まりました。より広い意味では、オプトジェネティクスのアプローチには、蛍光や生物発光を測定することでニューロンやその他の細胞の活動をモニタリングするための、遺伝子コード化バイオセンサーの使用も含まれます。遺伝子コード化カルシウム指示薬（GECI）はニューロン活動のモニタリングによく用いられますが、膜電位やセカンドメッセンジャー活性といった他の細胞パラメータも光学的に記録することができます。オプトジェネティクスセンサーの応用は神経科学に限定されず、免疫学、心臓病学、がん研究においてもますます重要な役割を果たしています。

歴史

タンパク質発現を介して細胞内カルシウム濃度を測定する最初の実験は、オワンクラゲ由来の発光タンパク質であるエクオリンに基づいていました。しかし、この酵素が光を生成するには、燃料化合物であるセレンテラシンが必要であり、これを調製物に加える必要があります。これは、無傷の動物では実用的ではなく、さらに、発光イメージングの時間分解能は比較的低いです（数秒～分）。動物の活動を画像化するために使用された最初の遺伝子コード化蛍光カルシウム指示薬（GECI）は、 1997年に宮脇篤、ロジャー・ツィエンと同僚によって設計されたカメレオンでした。 [1]カメレオンは、レックス・カー、ウィリアム・シェーファーと同僚によって、線虫C.エレガンスのニューロンと筋肉細胞からの記録に動物で初めて成功しました。[2]カメレオンはその後、ハエ[3]とゼブラフィッシュの神経活動の記録に使用されました。[4]哺乳類において、生体内で初めて使用されたGECIはGCaMP [5]であり、2001年に中井純一らによって開発されました。 [6] GCaMPは、ジャネリアファーム研究キャンパス（GENIEプロジェクト、HHMI ）の科学者チームを中心に、数多くの改良が重ねられ、特にGCaMP6 [7]は神経科学分野で広く利用されるようになりました。ごく最近では、Gタンパク質共役受容体を利用して、様々な神経伝達物質に対する非常に特異的な一連の指標が生成されています。[8] [9]

設計原則

遺伝子コード化センサーは、リガンド結合ドメイン（センサー）と蛍光タンパク質が短いリンカー（柔軟なペプチド）でつながれた融合タンパク質です。センサードメインが正しいリガンドに結合すると、構造が変わります。この動きは蛍光タンパク質に伝わり、結果として生じる変形が蛍光の変化につながります。このプロセスの効率はリンカー領域の長さに大きく依存し、リンカー領域の長さは労働集約的なプロセスで最適化する必要があります。蛍光タンパク質はしばしば循環的に並べ替えられ、つまり新しいC末端とN末端が生成されます。単波長センサーは定性測定には使いやすいですが、リガンド濃度の定量測定には較正が困難です。注目すべき例外は、 FLIM に適した寿命カルシウムバイオセンサー[10]です。

2 番目のクラスのセンサーは、異なる色の 2 つの蛍光タンパク質 (FP) 間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET) を利用します。波長の短い FP (ドナー) は、レーザーまたは LED からの青色光で励起されます。2 番目の FP (アクセプター) が非常に近い場合、エネルギーはアクセプターに移動され、黄色または赤色の蛍光が生じます。アクセプター FP がさらに離れると、ドナーは緑色の蛍光を発します。センサードメインは通常、2 つの FP 間でスプライスされており、リガンドが結合するとヒンジ型の動きが生じ、ドナーとアクセプター間の距離が変わります。FRET センサーの場合、イメージング手順はより複雑ですが、蛍光比を較正してリガンドの絶対濃度を測定できます。FRETプロセスは蛍光の減衰を加速するため、ドナー蛍光の蛍光寿命イメージング(FLIM) による読み出しも可能です。

光遺伝学センサーの利点

欠点、制限

遺伝子コード化指標のクラス

GCaMPの構造
カルシウム指示薬GCaMPのカルシウム結合型（上）とカルシウム非結合型（下）。Ca-カルモジュリン（シアン）がM13に結合すると、構造が変化し、cpGFPのバレルが閉じて緑色蛍光を発する。

指示薬は、イオン濃度、膜電位、神経伝達物質、そして様々な細胞内シグナル伝達分子を測定するために設計されています。以下のリストは各クラスのほんの一例であり、他にも多くの指示薬が発表されています。

細胞内シグナル伝達

神経伝達物質およびその他の細胞外シグナル

さらに読む

神経調節薬のためのGPCRベースの遺伝子コード化蛍光指標に関する最近のレビュー[9]

  • 蛍光バイオセンサーデータベースは、UCSDのJin Zhang研究室が管理する、公開されているセンサーとその基本特性を網羅した検索可能なリストです。[36]
  • 蛍光バイオセンサーは、非営利のプラスミドリポジトリであるAddgeneで入手可能です。

参考文献

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