同期抗力係数変化
SYBR Green I 染色された pUC19 DNA (2.7kb) が SCODA によって 1% アガロース ゲルの中央 (電極は存在しない) に濃縮されている様子を示すタイム ラプス シーケンス。

同期抵抗係数変化（SCODA）は、生体分子の精製、分離、および／または濃縮のためのバイオテクノロジー手法です。SCODAは、駆動場と同期して移動度（または抵抗）を変化させることができる分子を分離する能力を有します。この技術は主にDNAの濃縮と精製に利用されており、DNAの移動度は印加された電気泳動場に応じて変化します。[1] [2] [3]電気泳動SCODAは、 RNAやタンパク質でも実証されています。

理論

以下に示すように、SCODA 原理は、粒子の移動性が駆動場と同期して変化する力場によって駆動されるあらゆる粒子に適用されます。

SCODA原則

説明のために、電界中を移動（駆動）する電気泳動粒子を考える。

E = E ^ E 0 c o s ( ω t ) {\displaystyle E={\widehat {E}}E_{0}cos(\omega t)} （1）

そして d v x c o s 2 ω {\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}}

v → ( t ) = μ c o s ( ω t ) E ^ E 0 {\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=\mu cos(\omega t){\widehat {E}}E_{0}} （2）

は電場と、その電場中の粒子の速度を表す。が定数であれば、 の時間平均は となる。 μ {\displaystyle \mu } v → ( t ) = 0 {\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=0}

が時間の関数として一定でない場合、および の時間平均に比例する周波数成分を持つ場合、はゼロである必要はありません。 μ {\displaystyle \mu } μ {\displaystyle \mu } c o s ( ω t ) {\displaystyle cos(\omega t)} v → ( t ) {\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)}

次の例を考えてみましょう。

μ ( t ) = μ 0 + μ 1 c o s ( ω t ) {\displaystyle \mu (t)=\mu _{0}+\mu _{1}cos(\omega t)} （3）

(3)を(2)に代入し、時間平均を計算すると、次式が得られる。 v → ¯ {\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}}

v → ¯ = 1 2 μ 1 E ^ E 0 {\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}={\frac {1}{2}}\mu _{1}{\widehat {E}}E_{0}} （4）

したがって、印加電場の時間平均がゼロの場合でも、粒子にゼロ以外の時間平均速度、つまり正味の電気泳動ドリフトを経験させることが可能になります。

集束フィールドジオメトリの作成

力場の方向と平行な速度と電場の大きさの2乗に比例する速度を持つ力場下の粒子を考える（他の非線形性も採用できる[1]）。

v → = k E ^ ( E ) 2 {\displaystyle {\overrightarrow {v}}=k{\widehat {E}}(E)^{2}} （5）

粒子の有効移動度（ドリフト速度の小さな変化と電場の小さな変化との関係）は、直交座標で次のように表すことができます。 d v → {\displaystyle d{\overrightarrow {v}}} d E → {\displaystyle d{\overrightarrow {E}}}

d v x = ∂ v x ∂ E x d E x + ∂ v x ∂ E y d E y {\displaystyle dv_{x}={\partial v_{x} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{x} \over \partial E_{y}}dE_{y}} （6）
d v y = ∂ v y ∂ E x d E x + ∂ v y ∂ E y d E y {\displaystyle dv_{y}={\partial v_{y} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{y} \over \partial E_{y}}dE_{y}} （7）

(5)、(6)、(7)を組み合わせると次のようになります。

d v x = k [ ( E + E x 2 E ) d E x + ( E x E y E ) d E y ] {\displaystyle dv_{x}=k{\Biggl [}{\Biggl (}E+{\frac {E_{x}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}} （8）
d v y = k [ ( E x E y E ) d E x + ( E + E y 2 E ) d E y ] {\displaystyle dv_{y}=k{\Biggl [}{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}E+{\frac {E_{y}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}} （9）

さらに、平面に磁場 E が適用され、角周波数で反時計回りに回転する場合を考えます。この場合、磁場の成分は次のようになります。 ω {\displaystyle \omega }

E x = E c o s ( ω t ) {\displaystyle E_{x}=Ecos(\omega t)} （10）
E y = E s i n ( ω t ) {\displaystyle E_{y}=Esin(\omega t)} （11）

(10)と(11)を(8)と(9)に代入し、三角関数の恒等式を用いて簡略化すると、角周波数における正弦項と余弦項の定数項の和が得られる。次の計算では、角周波数における余弦項のみが非ゼロの正味漂流速度を与えるように行われる。したがって、これらの項のみを評価すればよい。これらの項はと と略記する。以下が得られる。 2 ω {\displaystyle 2\omega } 2 ω {\displaystyle 2\omega } d v x c o s 2 ω {\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}} d v y c o s 2 ω {\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}}

d v x c o s 2 ω = k E 2 [ c o s ( 2 ω t ) ] d E x {\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{x}} （12）
d v y c o s 2 ω = k E 2 [ c o s ( 2 ω t ) ] d E y {\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{y}} （13）

を、に比例する正弦波状に変化する強度の小さな四重極場の形にすると、次のようになります。 d E x {\displaystyle dE_{x}} d E y {\displaystyle dE_{y}} d E q {\displaystyle dE_{q}} c o s ( 2 ω t ) {\displaystyle cos(2\omega t)}

d E x = − d E q x c o s ( ω t ) {\displaystyle dE_{x}=-dE_{q}xcos(\omega t)} （14）
d E y = d E q y c o s ( ω t ) {\displaystyle dE_{y}=dE_{q}ycos(\omega t)} （15）

(14)と(15)を(12)と(13)に代入し、時間平均をとると次の式が得られる。

d v x ¯ = d v x c o s 2 ω ¯ = − k E d E q 4 x {\displaystyle {\bar {dv_{x}}}={\bar {dv_{x_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}x} （16）
d v y ¯ = d v y c o s 2 ω ¯ = − k E d E q 4 y {\displaystyle {\bar {dv_{y}}}={\bar {dv_{y_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}y} （17）

これをベクトル表記でまとめると次のようになります。

d v → ¯ = − k E d E q 4 r → {\displaystyle {\bar {d{\overrightarrow {v}}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}{\overrightarrow {r}}} （18）

式（18）は、すべての位置において時間平均速度が原点に向かう方向（粒子を原点に集中させる）にあり、速度は移動度係数k、回転場Eの強度、および摂動四重極場の強度に比例することを示している。 r → {\displaystyle {\overrightarrow {r}}} d E q {\displaystyle dE_{q}}

DNAの濃縮と精製

Auroraシステムを用いたSCODA DNA濃縮。A – DNAサンプルの注入。B、C、D – DNAサンプルの精製。図Dでは、DNAはSCODAの濃縮力とDC洗浄フィールドの間で平衡状態に達しています。E – 中央の抽出ウェルからピペッティングする準備が整った、濃縮されたDNAサンプル。

DNA分子は、長く荷電したポリマーであるという点で独特であり、アガロースゲルなどの分離媒体中では、電場に応じて高度に非線形な速度プロファイルを示す。そのため、SCODA [2]を用いることで、DNAは荷電されておらず、かつ強い非線形性も持たない他の分子から容易に分離することができる。

DNA注入

DNA分子のSCODA濃縮を行うには、サンプルを分離媒体（ゲル）内の最適な電気泳動強度の位置に埋め込む必要があります。このサンプルを最適な濃縮位置へ移動させることを「インジェクション」と呼びます。最適な位置は、ゲルの形状とSCODA駆動電極の位置によって決まります。まず、サンプルは濃縮ゲルに隣接するサンプルチャンバー内の緩衝液中に配置されます。インジェクションは、制御された直流電気泳動電界をサンプルチャンバー全体に印加することで実現され、すべての荷電粒子が濃縮ゲルへと移動します。サンプルの良好なスタッキング（すなわち、タイトなDNAバンド）を得るためには、複数の方法があります。例えば、サンプルチャンバーの緩衝液と濃縮ゲルの緩衝液の導電率比を利用する方法があります。サンプルチャンバーの緩衝液の導電率が低く、濃縮ゲルの緩衝液の導電率が高い場合、ゲルと緩衝液の界面で電界が急激に低下し、スタッキングが促進されます。

DNA濃度

DNAが濃縮ゲル内で最適な位置に配置された後、SCODA回転磁場が印加されます。磁場の周波数は、特定の長さのDNAのみが濃縮されるように調整できます。濃縮段階中の沸騰（ジュール熱を引き起こす可能性があります）を防ぐため、分離媒体を能動的に冷却することも可能です。また、SCODA磁場の位相を反転させることで、分子の焦点をぼかすことも可能です。

DNA精製

SCODAの濃縮力は非線形速度を示す粒子のみに作用するため、電気泳動場に線形に反応する小さな荷電粒子は濃縮されません。これらの粒子はSCODAゲルの中心に向かって螺旋状に移動する代わりに、一定の半径で周回します。SCODAの回転場に弱い直流電場を重畳すると、これらの粒子はSCODAゲルから「洗い流され」、ゲル中心部に高純度のDNAが残ります。

DNA抽出

SCODA DNAフォースにより、DNAサンプルはSCODAゲルの中央に集中します。DNAを抽出するために、ゲル内に予め抽出ウェルを形成し、バッファーで満たします。DNAはバッファー中で非線形移動を示さないため、抽出ウェルに蓄積されます。濃縮・精製段階の最後に、サンプルをこのウェルからピペットで取り出すことができます。

アプリケーション

A - SCODAゲルに注入する前の汚染度の高いサンプル。B - 注入後のSCODAゲル。C - 精製プロセス中のSCODAゲル。D - 精製プロセス終了時のSCODAゲル（目に見える汚染物質なし）。E - 写真DのSCODAゲルの蛍光画像。SCODAゲル中央に染色されたDNAが見える。

高分子量DNA精製

SCODA電気泳動力は、高分子量DNAをSCODAゲルの中心に向かって濃縮する際に、その完全性を維持するのに十分なほど穏やかです。サンプル中のDNAの長さに応じて、1Mbを超える長さのDNAを濃縮するための様々なプロトコルを使用できます。

汚染されたDNAの精製

SCODA法を用いて、緩衝液に再懸濁したタールサンドサンプルから直接DNAの濃縮と精製が行われた。その後DNA配列決定が行われ、暫定的に200種類以上の細菌ゲノムが同定された。[2] [4] SCODA法は、他の多くの環境源からのDNA精製にも使用されている。[5] [6]

シーケンス固有の

配列特異的 SCODA 中に、変異 DNA (緑) が野生型 DNA (赤) から分離されています。

ゲル中のDNAの非線形移動度は、サンプル中のDNA断片と相補的なDNAオリゴヌクレオチドをSCODAゲルに埋め込むことでさらに制御できます。 [7] [8]これにより、ゲルに埋め込まれたDNAと一致するサンプルDNAに対して、非常に特異的な非線形速度が得られます。この人工的な特異的非線形性を利用して、サンプル中の他のすべてのDNA配列を除去し、目的の配列のみを選択的に濃縮します。野生型と比較して、単一ヌクレオチド変異体の濃縮度が100万倍以上であることが実証されています。

この技術の応用として、血液サンプルから希少腫瘍由来DNA（ ctDNA ）を検出することが挙げられます。 [9]

参照

参考文献

  1. ^ ab Marziali, Andre; Pel, Joel; Bizzotto, Dan; Whitehead, Lorne A. (2005-01-01). 「同期交互抗力摂動に基づく新規電気泳動機構」.電気泳動. 26 (1): 82– 90. doi :10.1002/elps.200406140. ISSN  0173-0835. PMID  15624147. S2CID  12381185.
  2. ^ abc Pel, Joel; Broemeling, David; Mai, Laura; Poon, Hau-Ling; Tropini, Giorgia; Warren, René L.; Holt, Robert A.; Marziali, Andre (2009-09-01). 「非線形電気泳動応答は生体分子の分離に独自のパラメータをもたらす」. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 106 (35): 14796– 14801. Bibcode :2009PNAS..10614796P. doi : 10.1073/pnas.0907402106 . ISSN  0027-8424. PMC 2728113. PMID 19706437  . 
  3. ^ Joel, Pel (2009).同期抵抗係数変化（SCODA）に基づく選択的核酸濃縮のための新規電気泳動メカニズムと分離パラメータ（論文）. ブリティッシュコロンビア大学. doi :10.14288/1.0067696. hdl :2429/13402.
  4. ^ Voordouw, Gerrit. 「メタゲノミクスによるアルバータ州オイルサンドの微生物多様性の解明：石油回収率向上と環境問題解決への足がかり」（PDF） . Genome Alberta . 2016年4月20日閲覧。
  5. ^ Engel, Katja; Pinnell, Lee; Cheng, Jiujun; Charles, Trevor C.; Neufeld, Josh D. (2012-01-01). 「メタゲノミクスのための土壌DNA精製のための非線形電気泳動」. Journal of Microbiological Methods . 88 (1): 35– 40. doi :10.1016/j.mimet.2011.10.007. PMID  22056233. S2CID  10726081.
  6. ^ Charlop-Powers, Zachary; Milshteyn, Aleksandr; Brady, Sean F (2014). 「メタゲノム低分子化合物発見法」Current Opinion in Microbiology . 19 : 70– 75. doi :10.1016/j.mib.2014.05.021. PMC 4135586 . PMID  25000402. 
  7. ^ Thompson, Jason D.; Shibahara, Gosuke; Rajan, Sweta; Pel, Joel; Marziali, Andre (2012-02-15). 「DNAから希少配列を選別する：高度に特異的な配列とメチル化に基づくエンリッチメント」. PLOS ONE . 7 (2) e31597. Bibcode :2012PLoSO...731597T. doi : 10.1371/journal.pone.0031597 . ISSN  1932-6203. PMC 3280224. PMID  22355378 . 
  8. ^ Donald, Thompson, Jason (2011). SCODA（同期抵抗係数変化）に基づく核酸の配列特異的濃縮技術（論文）. ブリティッシュコロンビア大学. doi :10.14288/1.0071663. hdl :2429/33073.{{cite thesis}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  9. ^ Kidess, Evelyn; Heirich, Kyra; Wiggin, Matthew; Vysotskaia, Valentina; Visser, Brendan C.; Marziali, Andre; Wiedenmann, Bertram; Norton, Jeffrey A.; Lee, Mark (2015-02-10). 「大腸がん患者の血漿および腫瘍組織における腫瘍DNAの変異プロファイリング：新規高感度マルチプレックス変異検出プラットフォームを用いた」. Oncotarget . 6 (4): 2549– 2561. doi :10.18632/oncotarget.3041. ISSN  1949-2553. PMC 4385870. PMID  25575824 . 
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