末端制限酵素断片長多型

末端制限酵素断片長多型（TRFLP法、またはT-RFLP法）は、増幅された遺伝子の標識末端に最も近い制限酵素部位の位置に基づいて微生物群集のプロファイリングを行う分子生物学手法です。この手法は、単一遺伝子のPCR増幅変異体の混合物を1種類以上の制限酵素で消化し、得られた末端断片のサイズをDNAシーケンサーで検出することに基づいています。結果はグラフ画像で、x軸は断片のサイズ、y軸は蛍光強度を表します。

背景

TRFLPは、未知の微生物群集のフィンガープリントを生成することを目的としたいくつかの分子生物学的手法の1つです。他の同様の手法には、DGGE、TGGE、ARISA、ARDRA、PLFAなどがあります。 これらの比較的ハイスループットな手法は、クローンライブラリー
を用いた微生物群集の解析にかかるコストと労力を削減するために開発されました。この手法は、1994年にAvaniss-Aghajaniらによって初めて報告され[1]、その後1997年にLiuによって報告されました[2]。Liuは、いくつかの分離された細菌および環境サンプルのDNAから 16S rDNA標的遺伝子を増幅する方法を採用しました。それ以来、この手法は、機能マーカー遺伝子pmoAなどの他のマーカー遺伝子を用いてメタン資化性微生物群集を解析するため に適用されてきました

方法

他の多くのコミュニティ解析法と同様に、TRFLP法も標的遺伝子のPCR増幅に基づいています。TRFLP法では、プライマーの一方または両方の5'末端を蛍光分子で標識して増幅を行います。両方のプライマーを標識する場合は、異なる蛍光色素が必要です。6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、ROX、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA、ローダミンベースの色素）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）など、いくつかの一般的な蛍光色素をタグ付けの目的で使用できますが、最も広く使用されている色素は6-FAMです。次に、アンプリコンの混合物は、通常4カッター制限酵素を用いた制限反応にかけられます。制限反応後、断片の混合物は、DNAシーケンサーのキャピラリー電気泳動またはポリアクリルアミド電気泳動を使用して分離され、異なる末端断片のサイズが蛍光検出器によって決定されます。切り出されたアンプリコンの混合物をシーケンサーで解析するため、末端断片（つまり、アンプリコンの標識末端）のみが読み取られ、その他の断片は無視されます。したがって、T-RFLPは、すべての制限酵素断片が可視化されるARDRA法やRFLP法とは異なります。これらのステップに加えて、TRFLPプロトコルでは、制限酵素処理前のPCR産物のクリーンアップが含まれることが多く、キャピラリー電気泳動を使用する場合は、サンプルを泳動する前に脱塩段階も実行されます。

データ形式とアーティファクト

T-RFLPプロファイリングの結果は、電気泳動実験（ゲルまたはキャピラリー）の強度プロットを表す電気泳動図と呼ばれるグラフです。電気泳動図では、X軸は断片のサイズ、Y軸は各断片の蛍光強度を表します。したがって、電気泳動ゲル上にバンドとして現れるものは、電気泳動図上ではピークとして現れ、その積分値は総蛍光強度となります。T-RFLPプロファイルでは、各ピークは元のサンプル中の1つの遺伝子変異に対応し、その高さまたは面積は特定の集団におけるその変異の相対的存在量に対応します。しかし、上記の両方の仮定は必ずしも満たされるとは限りません。多くの場合、実験で使用された特定の制限酵素の制限酵素部位が同じ位置に存在するため、集団内の複数の異なる細菌が電気泳動図上で単一のピークを示すことがあります。この問題を克服し、この手法の分解能を向上させるために、1つのサンプルを複数の酵素（多くの場合3つ）で並行して消化することができます。これにより、サンプルごとに3つのT-RFLPプロファイルが作成され、それぞれが一部の変異を分離し、他の変異を分離しません。時々使用される別の変更は、異なる染料を使用してリバースプライマーも蛍光標識することです。この場合も、サンプルごとに 2 つの並列プロファイルが生成され、それぞれが異なる数の変異を解決します。

2 つの異なる遺伝子変異が 1 つのピークに収束することに加えて、主に偽ピークの形でアーティファクトが現れることもあります。偽ピークには一般に、バックグラウンド「ノイズ」と「疑似」TRF の 2 種類があります。[3]バックグラウンド (ノイズ) ピークは、使用中の検出器の感度から生じるピークです。これらのピークは強度が小さいことが多く、プロファイルの合計強度が低い場合 (つまり DNA の濃度が低い場合) に問題になることが多いです。これらのピークはバックグラウンド ノイズから生じるため、通常は複製プロファイルで再現できません。そのため、この問題は、複数の複製からコンセンサス プロファイルを作成するか、特定のしきい値を下回るピークを除去することで対処できます。この問題に対処するために、他の計算手法もいくつか導入されました。[4]一方、疑似 TRF は再現可能なピークであり、ロードされた DNA の量に比例します。これらのピークは、ssDNAが自己アニーリングして二本鎖のランダムな制限酵素部位を形成し、後に制限酵素によって認識され、真の遺伝子変異を示さない末端断片が生じる結果であると考えられています。消化段階の前に、緑豆エキソヌクレアーゼなどの DNAエキソヌクレアーゼを適用することで、このようなアーティファクトを除去できる可能性が示唆されています。

データの解釈

電気泳動図から得られるデータは、通常、次のいずれかの方法で解釈されます。

パターン比較

パターン比較では、異なるサンプルの電気泳動図の全体的な形状を、処理間のピークの有無、それらの相対的な大きさなどの変化について比較します

クローンライブラリによる補完

T-RFLP解析と並行してクローンライブラリを構築すれば、それらのクローンを用いてT-RFLPプロファイルを評価・解釈することができます。この方法では、各クローンのTRFは、直接（すなわち、個々のクローンに対してT-RFLP解析を行う）またはクローンの配列をin silico解析することによって決定されます。T-RFLPプロファイルをクローンライブラリと比較することで、各ピークが本物であることを検証できるだけでなく、ライブラリ内の各バリアントの相対的な存在量を評価することも可能になります。

データベースを使用したピーク解析

いくつかのコンピュータアプリケーションは、電気泳動図のピークをデータベース内の特定の細菌と関連付けようとします。通常、この種の分析は、単一サンプルから異なる制限酵素を用いて得られた複数のプロファイルを同時に解析することによって行われます。ソフトウェアは、プロファイル内のピークとデータベース内のエントリとの一致を最大化するようにプロファイルを解析し、一致する配列のないピークの数が最小限になるようにします。ソフトウェアは、解析されたすべてのプロファイルにTRFが含まれる配列のみをデータベースから削除します。

多変量解析

T-RFLPプロファイルを解析する方法として最近普及しているのが、多変量統計手法を用いてT-RFLPデータを解釈する方法です。[5]通常、適用される手法は生態学、特に生物多様性の研究で一般的に使用されているものです。その中でも、順位付けとクラスター分析が最も広く使用されています。T-RFLPデータに対して多変量統計解析を行うには、まずデータを「種別サンプル表」と呼ばれる表に変換する必要があります。この表は、異なるサンプル（T-RFLPプロファイル）と種（T-RFS）を、ピークの高さまたは面積を値として表します

利点と欠点

T-RFLPはフィンガープリンティング技術であるため、その利点と欠点は、主にDGGEなどの他の同様の技術と比較して議論されることがよくあります

利点

T-RFLPの主な利点は、自動シーケンサーを用いることで、繰り返しサンプルに対して高い再現性が得られることです。遺伝子プロファイルは完全に再現可能ではなく、現れるいくつかの小さなピークは再現不可能ですが、電気泳動図の全体的な形状と主要なピークの比率は再現可能と考えられます。結果をデジタル数値形式で出力する自動シーケンサーを用いることで、データの保存や異なるサンプルや実験の比較も容易になります。データの数値形式は、相対的（絶対的ではないものの）定量化や統計解析に利用されており、実際に用いられています。T-RFLPプロファイルから直接配列データを明確に推測することはできませんが、既存の配列にピークを「in-silico」で割り当てることはある程度可能です。

欠点

T-RFLPはDNA抽出法とPCRに依存しているため、両方に固有のバイアスが分析結果に影響を与えます。[6] [7]また、末端断片のみが読み取られるという事実は、末端制限酵素部位を共有する2つの異なる配列は、電気泳動図上で1つのピークのみとなり、区別がつかないことを意味します。実際、T-RFLPを複雑な微生物群集に適用すると、全体の多様性が通常20～50の異なるピークに圧縮され、それぞれが未知の数の異なる配列を表すだけになることがよくあります。この現象によりT-RFLPの結果は扱いやすくなりますが、当然のことながらバイアスが生じ、実際の多様性が過度に単純化されます。この問題を最小限に抑える（克服するわけではない）試みとして、複数の制限酵素を適用したり、両方のプライマーを異なる蛍光色素で標識したりすることがよくあります。T-RFLPから配列を取得できないと、T-RFLP分析と並行して1つ以上のクローンライブラリを構築して分析する必要が生じることが多く、労力が増加し、分析が複雑になります前述のように、偽（疑似）T-RFが出現する可能性も、もう一つの欠点です。この問題に対処するため、研究者はクローンライブラリ内の配列に関連付けられる可能性のあるピークのみを検討することがよくあります。

参考文献

  1. ^ Avaniss-Aghajani, E; Jones, K; Chapman, D; Brunk, C (1994). 「小サブユニットリボソームRNA配列を用いた細菌同定のための分子技術」BioTechniques . 17 (1): 144–149 . PMID  7946297
  2. ^ Liu, W; Marsh, T; Cheng, H; Forney, L (1997). 「16S rRNAをコードする遺伝子の末端制限酵素断片長多型の決定による微生物多様性の特徴づけ」. Appl. Environ. Microbiol . 63 (11): 4516– 4522. Bibcode :1997ApEnM..63.4516L. doi :10.1128/AEM.63.11.4516-4522.1997. PMC 168770. PMID 9361437  . 
  3. ^ Egert, M; Friedrich, MW (2003). 「疑似末端制限酵素断片の形成：PCR関連のバイアスが微生物群集構造の末端制限酵素断片長多型解析に及ぼす影響」. Appl. Environ. Microbiol . 69 (5): 2555– 2562. Bibcode :2003ApEnM..69.2555E. doi :10.1128/aem.69.5.2555-2562.2003. PMC 154551. PMID 12732521  . 
  4. ^ Dunbar, J; Ticknor, LO; Kuske, CR (2001). 「細菌群集由来16S rRNA遺伝子の系統学的特異性と再現性、および末端制限酵素断片プロファイル解析のための新手法」. Appl. Environ. Microbiol . 67 (1): 190– 197. Bibcode :2001ApEnM..67..190D. doi :10.1128/aem.67.1.190-197.2001. PMC 92545. PMID 11133445  . 
  5. ^ Abdo, Zaid; et al. (2006). 「16S rRNA遺伝子の末端制限酵素断片長多型解析による微生物群集の多様性特性評価のための統計的手法」.環境微生物学. 8 (5): 929– 938. Bibcode :2006EnvMi...8..929A. doi :10.1111/j.1462-2920.2005.00959.x. PMID  16623749.
  6. ^ Brooks, JP; Edwards, David J.; Harwich, Michael D.; Rivera, Maria C.; Fettweis, Jennifer M.; Serrano, Myrna G.; Reris, Robert A.; Sheth, Nihar U.; Huang, Bernice (2015-03-21). 「メタゲノミクスの真実：16S rRNA研究におけるバイアスの定量化と対策」BMC Microbiology . 15 (1): 66. doi : 10.1186/s12866-015-0351-6 . ISSN  1471-2180. PMC 4433096 . PMID  25880246. 
  7. ^ Sharifian, Hoda (2010年5月). 「PCR増幅中に誘発されるエラー」(PDF) .
  • キャピラリー電気泳動によるT-RFLPの改良プロトコル
  • 16S rRNA 遺伝子の末端制限酵素断片長多型の解析による微生物群集の多様性を特徴付ける統計的手法。
  • FragSort: オハイオ州立大学による、T-RFLP プロファイルの「in-silico」割り当て用ソフトウェア。
  • T-RFLP解析（APLAUS+）：アイダホ大学の微生物群集解析プロジェクトのウェブサイトにあるもう一つの「in-silico」割り当てツール
  • [1]: BEsTRF: ユーザー定義のプライマー酵素配列データベースに基づく末端制限酵素断片長多型解析の最適解を求めるツール
  • [2]: 微生物生態学における末端制限断片長多型（T-RFLP）の最初の10年間
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