アグロインフィルトレーション
植物バイオテクノロジーの方法

アグロインフィルトレーションは、植物生物学、特に最近では植物バイオテクノロジーにおいて、植物、植物から単離した葉、または植物細胞の培養物における遺伝子の一時的な発現を誘導して、目的のタンパク質を生成するために使用される方法である。この方法では、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を直接注入または真空浸潤によって植物の葉に導入するか、多孔質支持体上に固定化された植物細胞（植物細胞パック）と会合させ、[1]その後、細菌がT-DNAの転移を介して目的の遺伝子を植物細胞に移す。より伝統的な植物形質転換と比較した場合のアグロインフィルトレーションの主な利点はスピードと利便性であるが、組み換えタンパク質の収量も一般的に高く、より安定している。

最初のステップは、目的の遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株に導入することです。その後、この株を液体培地で培養し、得られた細菌を洗浄して適切な緩衝液に懸濁します。注入のために、この溶液を注射器（針なし）に入れます。注射器の先端を葉の裏側に押し当てながら、同時に葉の反対側に軽く逆圧力をかけます。アグロバクテリウム懸濁液は、気孔、あるいは場合によっては葉の裏側に小さな切り込みを通して、葉の内部の気腔に注入されます。

真空浸潤法は、アグロバクテリウムを植物組織の深部まで導入するもう一つの方法です。この方法では、葉片、葉、または植物全体を溶液の入ったビーカーに浸し、ビーカーを真空チャンバーに入れます。次に真空状態にすることで、気孔から葉の細胞間隙から空気が排出されます。真空状態が解除されると、圧力差によって「アグロバクテリウム」懸濁液が気孔から葉肉組織へと押し出されます。これにより、どの葉でもほぼすべての細胞が細菌と接触することになります。

アグロバクテリウムは葉の中に入ると細胞間隙に留まり、目的の遺伝子を Ti プラスミド由来の T-DNA の一部として高コピー数で植物細胞に導入する。遺伝子導入は、植物からのシグナルが誘導され、植物細胞と細菌が物理的に接触したときに起こる。細菌は穴を掘り、新しい T-DNA 鎖を植物細胞に導入するメカニズムを作り出す。T-DNA は植物の核に移動し、植物の染色体への組み込みが始まる。その後、遺伝子は、導入されたすべての細胞において適切なプロモーター配列からの RNA 合成によって一時的に発現される（安定的な組み込みのための選択は行われない）。植物は、表現型への影響をモニタリングしたり、実験条件にかけたり、収穫して目的のタンパク質の精製に使用したりすることができる。多くの植物種がこの方法で処理できるが、最も一般的なのはNicotiana benthamianaであり、頻度は低いがNicotiana tabacumである。

培養植物細胞パックにおける一過性発現は、ドイツのフラウンホーファー研究所IVVによって最近特許が取得された新しい手法である。[2]この技術では、タバコの懸濁培養細胞（例： Nicotiana tabacum のNT1またはBY2細胞株）を濾過により多孔質支持体上に固定化し、通気性の良い細胞パックを形成する。その後、組換えアグロバクテリウムとともにT-DNAの転移が可能な時間インキュベートし、再濾過により余分な細菌と液体を除去する。細胞パックを湿潤環境で数日間までインキュベートすることで、タンパク質の一過性発現が可能になる。分泌されたタンパク質は、緩衝液を加えてさらに濾過することで細胞パックから洗い流すことができる。

農業浸透における抑制因子のサイレンシング

Nicotiana benthamianaにおける、TBSV p19 あり (右の葉ディスク) と TBSV p19 なし (左の葉ディスク) の、promoter::GUS 構築物を使用したアグロインフィルトレーション。

目的の構築物を持つアグロバクテリウムを、植物病原性のトマトブッシースタントウイルス（TBSV）のp19タンパク質やトマト黄化えそウイルス（TSWV）のNSsタンパク質[3]をコードする遺伝子などのサイレンシング抑制タンパク質遺伝子を持つ別のアグロバクテリウムと共浸潤させることは非常に一般的です。 TBSVは1935年にトマトで初めて発見され、植物の成長を阻害し、果実を変形させます。 TSWVは1915年にオーストラリアのトマトで発見され、長年、現在トスポウイルス属、ブニヤウイルス科として知られる唯一のメンバーでした。アセトシリンゴンはまた、形質転換効率を高め、目的の構築物を発現させるためにアグロ浸潤培地に一般的に添加されます。

植物は、細胞内に外来核酸を導入するウイルスやその他の病原体から身を守るために、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）のシステムを開発しました。このシステムでは、二本鎖RNAから小さな干渉RNAが生成され、非在来遺伝子を効率的にサイレンシングする特定の配列分解経路が作成されます。[4] [5]多くの植物ウイルスは、p19やNSなどの進化したタンパク質によって、さまざまなレベルでPTGS経路を阻害することで、植物のPTGSシステムに対抗するメカニズムを開発しました。[6] [7] [8]

p19がどのようにRNAサイレンシングを抑制するのかは正確には明らかではないが、ニコチアナ・ベンサミアナの葉で一時的に発現したタンパク質は、TBSV p19と共浸潤すると最大50倍の収量が得られることが研究で示されている。[9] [10]

TSWVおよびその他のトスポウイルスNSタンパク質は、局所的および全身的サイレンシングの両方の抑制因子として有効であることが示されており[11]、p19が効果的でないと示されている場合に、p19の有用な代替となる可能性があります。他の研究では、アーティチョーク斑入りクリンクルウイルス由来のp19が、TBSV p19と同様の、しかしより弱い効果を持つことが示されています[12] 。しかし、p19タンパク質は特定の植物種（例：ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum pv. petit Gerard））において過敏反応を引き起こすことが知られているエフェクターであることに注意する必要があります。

参照

参考文献

  1. ^ 「植物細胞パック（別名「クッキー」）技術」。
  2. ^ 「植物細胞パックの生成および栽培方法」。
  3. ^ Takeda, A; Sugiyama, K; Nagano, H; Mori, M; Kaido, M; Mise, K; Tsuda, S; Okuno, T (2002). 「トマト黄化えそウイルスの新規RNAサイレンシング抑制因子NSsタンパク質の同定」FEBS Lett . 532 ( 1– 2): 75– 9. Bibcode :2002FEBSL.532...75T. doi : 10.1016/s0014-5793(02)03632-3 . PMID  12459466.
  4. ^ ハモンド, スコット・M.; コーディ, エイミー・A.; ハノン, グレゴリー・J. (2001年2月). 「二本鎖RNAによる転写後遺伝子サイレンシング」. Nature Reviews Genetics . 2 (2): 110– 119. doi :10.1038/35052556. PMID  11253050. S2CID  2864720.
  5. ^ Johansen, Lisa K.; Carrington, James C. (2001-07-01). 「Silencing on the Spot. Agrobacterium-Mediated Transient Expression System におけるRNAサイレンシングの誘導と抑制」. Plant Physiology . 126 (3): 930– 938. doi :10.1104/pp.126.3.930. ISSN  1532-2548. PMC 1540124. PMID 11457942  . 
  6. ^ Anandalakshmi, Radhamani; Pruss, Gail J.; Ge, Xin; Marathe, Rajendra; Mallory, Allison C.; Smith, Trenton H.; Vance, Vicki B. (1998-10-27). 「植物における遺伝子サイレンシングを抑制するウイルス」. Proceedings of the National Academy of Sciences . 95 (22): 13079– 13084. Bibcode :1998PNAS...9513079A. doi : 10.1073/pnas.95.22.13079 . ISSN  0027-8424. PMC 23715. PMID 9789044  . 
  7. ^ Kasschau, Kristin D.; Carrington, James C. (1998-11-13). 「植物ウイルスに対する対抗防御戦略」. Cell . 95 (4): 461– 470. doi : 10.1016/S0092-8674(00)81614-1 . ISSN  0092-8674. PMID  9827799.
  8. ^ Voinnet, Olivier (2001-08-01). 「ウイルスに対する植物免疫システムとしてのRNAサイレンシング」. Trends in Genetics . 17 (8): 449– 459. doi :10.1016/S0168-9525(01)02367-8. ISSN  0168-9525. PMID  11485817.
  9. ^ Voinnet, Olivier; Rivas, Susana; Mestre, Pere; Baulcombe, David (2003-03-01). 「撤回：トマトブッシースタントウイルスのp19タンパク質による遺伝子サイレンシングの抑制に基づく植物における強化一過性発現システム」. The Plant Journal . 33 (5): 949– 956. Bibcode :2003PlJ....33..949V. doi : 10.1046/j.1365-313X.2003.01676.x . ISSN  1365-313X. PMID  12609035. S2CID  2412771.（撤回済み、doi :10.1111/tpj.13066、PMID  27170951、Retraction Watchを参照）
  10. ^ 「撤回：『トマトブッシースタントウイルスのp19タンパク質による遺伝子サイレンシングの抑制に基づく植物における強化された一過性発現システム』」The Plant Journal . 84 (4): 846. 2015年11月1日. Bibcode :2015PlJ....84..846.. doi : 10.1111/tpj.13066 . ISSN  1365-313X. PMID  27170951.
  11. ^ ヘディル、M;スターケン、MG;ド・ロンド、D;ロハウス、D;コーメリンク、R (2015)。 「全身的サイレンシングの抑制におけるトスポウイルス NSs タンパク質の分析」。プロスワン。10 (8) e0134517。ビブコード:2015PLoSO..1034517H。土井：10.1371/journal.pone.0134517。PMC 4537313。PMID  26275304。 
  12. ^ ロンバルディ、ラファエーレ;チルチェッリ、パトリツィア。ヴィラーニ、マリア。ブリアーニ、ジャンパオロ。ナルディ、ルカ。コッポラ、ヴァレンティーナ。ビアンコ、リンダ。ベンヴェヌート、エウジェニオ。ドニーニ、マルチェッロ (2009-11-20)。 「タイトルウイルスのアーティチョークまだらクリンクルのスペルミスのP19遺伝子サイレンシングサプレッサータンパク質を使用したベンサミアナタバコにおける高レベルHIV-1 Nef一過性発現」。BMCバイオテクノロジー。9 (1): 96.土井: 10.1186/1472-6750-9-96。PMC 2785776。PMID  19930574。 
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