抗体マイクロアレイ
タンパク質マイクロアレイの形態
抗体マイクロアレイの作成と検出のサンプル

抗体マイクロアレイ（抗体アレイとも呼ばれる）は、タンパク質マイクロアレイの特殊な形態である。この技術では、捕捉された抗体の集合体をガラス、プラスチック、膜、シリコンチップなどの固体表面にスポットして固定し、抗体と標的抗原との相互作用を検出する。抗体マイクロアレイは、血清、血漿、細胞または組織溶解物など、様々な生体液からのタンパク質発現を検出するためによく用いられる。抗体アレイは、基礎研究だけでなく、医療・診断用途にも利用できる。 [1] [2] [3] [4]

背景

抗体マイクロアレイの概念と手法は、 1983年にツェ・ウェン・チャン（Tse Wen Chang）がペンシルベニア州マルバーンのセントコア社で勤務していた際に、科学論文[5]と一連の特許[6] [7] [ 8] で初めて発表されました。チャンは「抗体マトリックス」という用語を考案し、小さなガラスやプラスチックの表面上に微小な抗体スポットを「アレイ」状に配列する手法について論じました。彼は、1×1 cmの表面に10×10（合計100個）および20×20（合計400個）の抗体スポットのグリッドを配置できることを実証しました。また、ほとんどの抗体にとって最適な濃度である10 μg/mLで抗体をコーティングした場合、1 mgの抗体で直径0.25 mmのドットを2,000,000個作成できると推定しました。チャンの発明は、CD抗原やHLAアロタイプ抗原などの特定の表面抗原、ウイルスや細菌などの粒子状抗原、そして可溶性抗原を有する細胞の検出と定量化を目的とした抗体マイクロアレイの利用に焦点を当てていました。論文や特許に記載されている「1回のサンプル塗布で複数回の測定」という原理、アッセイ構成、そして吸収ドットを配置するメカニズムは、さまざまな種類のマイクロアレイに一般的に適用できるはずです。ツェ・ウェン・チャンとナンシー・T・チャンは、1986年にテキサス州ヒューストンでTanox , Inc.を設立した際、新しいスタートアップ企業を設立するための技術基盤の一部として、セントコア社から抗体マトリックス特許の権利を購入しました。彼らが開発した最初の製品は、「免疫吸着サイトメトリー」[9]と呼ばれるアッセイで、 HIV感染者の血液中の免疫状態、すなわちCD3 +、CD4 +、CD8 + T細胞の濃度と比率をモニタリングするために使用できました。

タンパク質マイクロアレイに基づくリガンド結合アッセイの理論的背景は、1980年代後半にロジャー・エキンスらによってさらに発展しました。[10] [11] [12] このモデルによれば、抗体マイクロアレイは、分析対象物質パネルの同時スクリーニングを可能にするだけでなく、従来のスクリーニング法よりも感度と迅速性も向上します。大規模なタンパク質セットのスクリーニングへの関心は、DNAマイクロアレイとヒトゲノムプロジェクトによるゲノミクスの成果の結果として初めて高まりました。

最初のアレイアプローチは、通常96ウェルマイクロタイタープレートで行われる生化学アッセイおよび免疫生物学的アッセイの小型化を試みたものであった。96ウェルプレートベースの抗体アレイはハイスループット能力を有するものの、各ウェルの表面積が小さいため、抗体スポットの数、ひいては検出される分析対象物の数に制限があった。その後、ガラススライドやニトロセルロース膜などの他の固体支持体が、より大規模な抗体パネルに対応できるアレイの開発に利用されるようになった。[13]ニトロセルロース膜ベースのアレイは柔軟性があり、取り扱いが容易で、タンパク質結合容量も高いが、ハイスループット化や自動化処理には適していない。化学的に誘導体化されたガラススライドは、サブマイクロリットルサイズの抗体スポットの印刷を可能にし、スポット密度を犠牲にすることなくアレイの表面積を縮小する。これにより、サンプルの消費量も削減される。ガラススライドベースのアレイは、滑らかで剛性の高い構造のため、ハイスループット液体処理システムにも容易に適合する。

ほとんどの抗体アレイシステムは、非競合的な免疫検出法である単一抗体（標識ベース）検出と2抗体（サンドイッチベース）検出のいずれかを採用しています。後者の方法で分析対象物を検出するには、それぞれ異なるエピトープに結合する2つの異なる抗体（捕捉抗体とレポーター抗体）の結合が必要ですが、標識ベースの免疫検出（捕捉抗体は1つだけ使用し、開始サンプル中のすべてのタンパク質を化学的に標識することで検出）と比較して、より高い特異性と低いバックグラウンドシグナルが得られます。サンドイッチベースの抗体アレイは、通常、あらゆるアレイ形式の中で最も高い特異性と感度（ng～pgレベル）を達成します。また、その再現性により定量分析も可能です。[14] [15]パネル内の他のすべての抗体と適合する抗体ペアを開発することが困難なため、小規模アレイではサンドイッチアプローチが用いられることが多いです。一方、単一抗体標識ベースのアプローチを用いることで、高密度アレイの開発が容易になり、コストも削減されます。この方法では、特定の抗体のセットが使用され、サンプル内のすべてのタンパク質が蛍光染料またはハプテンによって直接標識されます。

抗体ベースのアレイシステムの初期の用途には、IgGおよび特定のサブクラスの検出、[16] [17]抗原の分析、[18]組み換え抗体のスクリーニング、[19] [20]酵母タンパク質キナーゼの研究、[21]自己免疫抗体の分析、[22]タンパク質間相互作用の調査などがありました。[23] [24] [25]抗体アレイ技術を使用して生理学的サンプルから複数のサイトカインを同時に検出する最初のアプローチは、2001年にRuo-Pan Huangと同僚によって行われました。[26]彼らのアプローチでは、Hybond ECLメンブレンを使用して、細胞培養の調整培地と患者の血清から24種類のサイトカインの小さなパネルを検出し、生理学的レベルでのサイトカイン発現をプロファイリングすることができました。 Huangはこの技術を採用して新しいビジネスであるRayBiotech, Inc.を設立し、平面抗体アレイの商業化に初めて成功しました。

過去10年間で、表面化学の最適化と化学標識のための専用プロトコルの開発により、この方法の感度が向上しました。[27]現在、抗体アレイの感度はELISAと同等であり[28] [29] 、抗体アレイは組織サンプル、血漿または血清サンプル、その他多くのサンプルのプロファイリング実験に日常的に使用されています。抗体アレイに基づくプロファイリング研究の主な焦点の一つは、特にがんにおけるバイオマーカーの発見 です。[30] [31] [32] [33] [34]がん関連の研究では、810種類のがん関連抗体を含む抗体アレイの開発と応用が2010年に報告されました。[35]また、2010年には、507種類のサイトカイン、ケモカイン、アディポカイン、成長因子、血管新生因子、プロテアーゼ、可溶性受容体、可溶性接着分子、およびその他のタンパク質を含む抗体アレイが、卵巣がん患者と健康な人の血清のスクリーニングに使用され、正常サンプルとがんサンプルの間でタンパク質発現に有意な差があることがわかりました。[36]最近では、抗体アレイは、神経膠腫に関連し、診断の何年も前にリスクを軽減できる特定のアレルギー関連血清タンパク質を決定するのに役立っています。[37]抗体アレイによるタンパク質プロファイリングは、がん研究以外の分野、特にアルツハイマー病などの神経疾患でも成果を上げています。アルツハイマー病患者を識別できるバイオマーカーパネルを特定しようとする研究は数多く行われており、その多くは抗体アレイを用いています。イェーガー氏らは、アルツハイマー病で影響を受ける生物学的経路とネットワークを発見するために、約600種類の循環タンパク質を測定し、個々のタンパク質とネットワークのレベルとアルツハイマー病患者の認知能力との正負の関係を調査しました。[38]現在、市販されている最大のサンドイッチベースの抗体アレイは、1000種類の異なるタンパク質を検出します。[39]さらに、抗体マイクロアレイに基づくタンパク質プロファイリングサービスも提供されており、1030種類のタンパク質のタンパク質量とリン酸化またはユビキチン化状態を並行して分析することができます。 [40]

抗体アレイは、多くの種類のサンプルからのタンパク質発現の検出によく使用されますが、さまざまな調製方法のサンプルでも使用されます。Jiang らは、血清と乾燥血液スポットという 2 種類の異なる血液調製物におけるアレイタンパク質発現の相関関係をわかりやすく示しました。[41]これらの異なる血液サンプル調製物は、サンドイッチベース、定量的、ラベルベースの 3 つの抗体アレイ プラットフォームを使用して分析され、タンパク質発現に強い相関関係が見られました。これは、特に入院していない公衆衛生領域において、より便利で安全かつ安価な血液採取手段である乾燥血液スポットが、抗体アレイ分析と併用することで、バイオマーカーの発見、タンパク質プロファイリング、疾患のスクリーニング、診断、治療に効果的に使用できることを示唆しています。

アプリケーション

抗体マイクロアレイは、様々な医療診断分野において研究者の注目を集めています。デジタルバイオアッセイは、そのような研究分野の一例です。この技術では、ガラス/ポリマーチップ上のマイクロウェルアレイに磁性ビーズ（蛍光標識抗体でコーティング）を播種し、標的抗原に曝露した後、蛍光を発するウェルを顕微鏡で計数することで特性評価を行います。このようなマイクロウェルアレイを低コストで製造するためのプラットフォーム（OSTEポリマーを使用）が最近実証され、バイオアッセイモデルシステムの特性評価に成功しました。[42]さらに、チオール-エン「合成紙」マイクロピラースキャフォールドを用いた免疫アッセイは、優れた蛍光シグナルを生成することが示されています。[43]

参照

参考文献

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