高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC ）は薄層クロマトグラフィー（TLC）の拡張版として機能し、化合物の定量分析において堅牢性、簡便性、速度、効率性を実現します。[1]このTLCベースの分析技術は、定量分析における化合物の分解能を向上させます。これらの改善点の一つとして、固定相に粒子径の細かい高品質TLCプレートを使用することで、分解能が向上します。[2]さらに、多重展開装置を用いたプレート展開を繰り返すことで、分離をさらに精密化できます。その結果、HPTLCは優れた分解能と低い検出限界（LOD）を実現します。[3]
機器
HPTLCの利点[1]
- 並列に分離された複雑なサンプルまたは天然サンプル内の個々の化合物から生じる効果に関するわかりやすい情報を提供します。
- クロマトグラフィー分離と、酵素アッセイまたは生物学的アッセイを使用した効果指向検出を組み合わせます。
- 高解像度質量分析法を使用してサンプルから重要な化合物を選択し、さらに特性評価するのに役立ちます。
- スーパーハイフネーション、最小限のサンプル準備要件、多重変調化合物の検出、アゴニスト効果とアンタゴニスト効果の区別などの独自の利点を提供します。
モード
HPTLCには、リニアモード、サーキュラーモード、アンチサーキュラーモードの3つのモードがあります。これらのモードの中で、アンチサーキュラーモードはHPTLCの領域において、理論上も実践上も最も高速なモードとして際立っています。このモードでは、移動相が外側の円形の経路に沿ってプレート層に正確に流入し、その後ほぼ一定の速度で中心に向かって流れることで分離を実現します。このアプローチは、時間、層、および移動相の消費を最小限に抑えながらサンプル容量を最大化するため、最も費用対効果の高いHPTLC技術となっています。アンチサーキュラーHPTLC特有の狭いスポットパスは、自動定量を容易にします。リニアモードおよびサーキュラーモードと比較すると、アンチサーキュラーモードは優れた分離と、特に高いRf値で大幅に向上した感度を示します。[2]
方法論
HPTLCを始めるには、混合物中の異なる化合物を分離するための固定相を決定する必要があります。すべての医薬品分離の約90%は順相シリカゲルで行われていますが、解離性化合物を含むサンプルにはアルミナ、イオン性化合物にはセルロースなどの他の固定相を使用できます。 [4]逆相HPTLC法（逆相TLCと同様の方法論）は、極性の高い化合物に使用されます。固定相を選択した後、プレートは通常、メタノールで洗浄し、オーブンで乾燥させて余分な溶媒を除去します。[5]
移動相の選択はHPTLCにおいて最も重要なプロセスの一つであり、「試行錯誤」の過程を辿ります。しかしながら、「PRISMA」システムは最適な移動相を見つけるためのガイドラインとなります。[1]移動相は、固定相の吸光度と対象化合物の組成に依存します。[5]対象化合物は、まず、通常相HPTLCの場合はジエチルエーテル、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルムなどの溶液、逆相HPTLCの場合はメタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの溶液で試験されます。次に、選択された溶媒に対する化合物の遅延係数（R f ）を分析し、最大のR fを与える溶媒を化合物の移動相として選択します。次に、ヘキサン（通常相HPTLCの場合）および水（逆相HPTLCの場合）に対する移動相溶媒の強度を試験し、調整の必要性を判断します。[5] [6]
CAMAGのLinomat 5や自動TLCサンプラー4（ATS 4）などの著名なHPTLC装置は、自動化された「スプレーオン」サンプル塗布技術を備えているため、非常によく似ています。[4] [5]この自動化された「スプレーオン」技術は、サンプルをTLCプレートに手動で塗布する際の液滴サイズと位置の不確実性を克服するのに役立ちます。さらに、サンプルがプレートに接触するとすぐに溶媒が蒸発するため、自動化により高解像度と狭いバンドが得られます。[4]自動化への1つのアプローチは、サンプル塗布に圧電デバイスとインクジェットプリンターを使用することです。 [7]一方、CAMAGのNanomat 4とATS 4は手動で操作され、キャピラリーピペットを使用してサンプルをスポット塗布します。[4] [5]
クロマトグラフィー検出では、最適な結果を得るために、HPTLCプレートは通常、飽和ツイントラフチャンバーでろ紙を用いて展開されます。[5] [6]ただし、特定の化合物では平底チャンバーや水平展開チャンバーも使用されます。 HPTLCデバイスの一般的なメカニズムは次のとおりです。[5]適合したろ紙をチャンバーの後ろのトラフに配置し、移動相を後ろのトラフから注ぎ、ろ紙への溶媒の完全な吸収を確実にします。次に、チャンバーを約45°傾けて両方のトラフの溶媒容量を等しくし、約20分間放置して平衡化させます。[5]最後に、HPTLCプレートをチャンバーに配置して展開します。各サンプルの読み取りの間に、移動相とろ紙を交換して、最良の結果を確保します。
スポットキャパシティ（HPLCにおけるピークキャパシティに相当）は、二次元クロマトグラフィーを用いて、プレートを2種類の異なる溶媒で展開することで増加させることができる。[8]この手順は、サンプルを充填したプレートを最初の溶媒で展開することから始まる。最初の溶媒を取り除いた後、プレートを90°回転させ、2番目の溶媒で展開する。
アプリケーション
HPTLCは、その数多くの利点により、製薬業界、臨床化学、法医学、生化学、化粧品、食品・医薬品分析、環境分析など、様々な分野で幅広く応用されています。結果を画像として提示できる唯一のクロマトグラフィー法であること、簡便性、費用対効果、サンプルの並列分析、高いサンプル容量、迅速な結果取得、そして複数の検出法を選択できることが、HPTLCの特徴です。
ル・ルーの研究チームは臨床試験でサルブタモールの血清濃度を測定するためのHPTLCを評価し、それが血清サンプルを分析するのに適した方法であると結論付けました。[3]
HPTLCは、地衣類学において地衣類物質の分析と同定に有用であることが証明されています。標準的なTLCと比較して、この技術は地衣類化合物のスクリーニングにおいていくつかの利点があります。1枚のプレートで2倍のサンプルを分析でき、必要な溶媒量が大幅に少なくて済みます（プレート1枚あたり250 mLに対して4 mL）、クロマトグラフィー分離がプレート1枚あたり10分未満で完了し、はるかに低濃度の物質を検出できます。この方法の感度向上により、これまで未同定だった地衣類化合物の検出が可能になり、地衣類種間の化学的多様性がより大きく明らかになりました。1990年代初頭以降、HPTLCは地衣類物質の日常的なスクリーニングにおいて標準的なTLCの改良された代替手段として使用されていますが、この技術は標準的なTLCよりも大気湿度の影響を受けやすいため、適切なプレート乾燥が不可欠です。[9]
HPTLCは様々な脂質サブクラスの分離にも効果的に使用されており、20種類の脂質サブクラスにおいて再現性の高い有望な結果が得られています。臨床医学研究に関する多数の報告が様々な学術誌に掲載されています。その結果、血清やその他の組織中の薬物分析にはHPTLCが強く推奨されています。[7]
参考文献
- ^ abc Morlock, Gertrud E. (2021年10月2日). 「高性能薄層クロマトグラフィーと効果指向アッセイおよび高分解能質量分析を組み合わせた、新たなハイフン技術：チュートリアルレビュー」Analytica Chimica Acta . 1180 338644. Bibcode :2021AcAC.118038644M. doi : 10.1016/j.aca.2021.338644 . ISSN 0003-2670. PMID 34538319. S2CID 236348479
- ^ ab Kaiser, RE (1978年9月). 「反循環型高性能薄層クロマトグラフィー」 . Journal of High Resolution Chromatography . 1 (3): 164– 168. doi :10.1002/jhrc.1240010309. ISSN 0935-6304.
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- ^ Arup, Ulf; Ekman, Stefan; Lindblom, Louise; Mattsson, Jan-Eric (1993). 「高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）―地衣類物質のスクリーニングのための改良技術」. The Lichenologist . 25 (1): 61– 71. Bibcode :1993ThLic..25...61A. doi :10.1006/lich.1993.1018.
