プロモーターバッシング
分子生物学の側面
プロモーターバッシング
仮想的な2領域プロモーターのプロモーターバッシング。プロモーターはlacZレポーター遺伝子の上流にクローニングされる。各領域を不活性化する点変異（赤いX印）が作製され、その領域はプラスミド上にクローニングされ、大腸菌細胞に挿入されて増殖し、レポーターの存在が測定される。この例におけるタンパク質Bの結合は、RNAポリメラーゼが結合して転写を開始するために必要である。
実験室環境では、プロモーターが2つの領域で構成されていることがわからない場合もある。プロモーターに沿って単一の変異を作製し、プロモーターを配列決定し、レポーターのレベルを測定することで、各領域の境界を見つけることができる。

プロモーターバッシングは、分子生物学において、 DNA鎖の特定の領域（一般的にはプロモーター）が下流遺伝子の転写にどのように影響するかを同定する手法である。通常、タンパク質はプロモーターに結合し、転写を活性化または抑制する。プロモーターバッシングアッセイでは、プロモーターの特定の領域に特定の点変異または欠失を生じさせ、遺伝子の転写を測定する。プロモーター領域の寄与は転写レベルによって観察できる。変異または欠失によって転写レベルが変化する場合、そのプロモーター領域は結合部位またはその他の調節要素である可能性がある。[1] [2] [3]

プロモーターバッシングは、DNA鎖の5'末端または3'末端のいずれかを欠失させることで行われることが多い。このアッセイは、制限酵素処理を繰り返し、特定のサイズの断片をゲル精製することで実施できるため、比較的容易である。プロモーターをレポーターにライゲーションし、PCRまたは細菌培養によってレポーターコンストラクトを大量に生成し、このサンプルに対して連続制限酵素処理を施すのが最も簡単な方法である。上流プロモーターの能力は、DNA鎖の5'末端から断片を除去することで容易に評価でき、下流プロモーターについても同様に3'末端から断片を除去することで評価できる。[4]

プロモーターには通常、転写を制御するタンパク質の結合配列が含まれているため、これらのタンパク質もプロモーターの機能を評価する上で不可欠です。プロモーターと結合するタンパク質は、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて同定でき、変異誘発されたプロモーターにこれらのタンパク質を含めるか除外するかの影響をアッセイで評価できます。これにより、プロモーターバッシングを用いることで、転写に影響を与えるDNA鎖上の位置だけでなく、その鎖に影響を与えるタンパク質も発見できます。タンパク質同士の相互作用や結合部位の影響もこの方法で評価できます。候補タンパク質は、EMSAではなく、タンパク質/タンパク質相互作用アッセイによって同定する必要があります。[5]

手順

これはBoulinら[6]から改変したプロモーターバッシングアッセイの手順例である。

  1. プロモーターとして機能すると考えられるDNA領域をクローニングします。 クローニングは、プロモーターが発現に影響を与える唯一の因子であることを保証するために、アッセイに不可欠です。このステップでは、プロモーターが存在する生物からDNAを抽出し、PCR増幅を行うことがよくあります。
  2. 当該領域の配列を解析します。DNA 配列解析は、変異プロモーターと野生型プロモーターの違いを特定し、それらの違いと遺伝子発現の違いを相関させるために不可欠です。さらに、当該領域の制限酵素処理にも役立ちます。
  3. 適切な制限酵素で消化する。プロモーターの一部ではないと考えられる要素を除去するために、領域を消化することができる。さらに、ほとんどのプロモーターでは、レポーター遺伝子をプロモーターから一定の距離を置いて挿入する必要がある。プロモーターバッシングのいくつかの手法では、複数の制限酵素消化を用いてプロモーターの要素を体系的に除去する。この手法により、除去されたプロモーター領域がレポーターの発現に寄与しないことが保証される。
  4. プロモーターを変異させる。制限酵素処理によってプロモーターの一部を除去する方法を用いない場合、プロモーターを変異させる必要がある。多数の変異鎖を生成し、それらの配列を解析してプロモーターの活性をアッセイすることができる。1つの変異では結合部位が不活性化されることが保証されないため、この手順はしばしば必要となる。非特異的PCRに基づく変異誘発法も使用可能であり、変異誘発PCR反応のパラメータを調整することで、適切な数の変異を導入することができる。しかし、PCRのランダム性のため、このステップの下流でより多くの鎖をアッセイする必要がある。
  5. レポーター遺伝子に連結する。アッセイ対象のプロモーターは、遺伝子発現レベルを測定できるようにレポーター遺伝子に連結する必要があります。レポーター遺伝子は、野生型のプロモーターが遺伝子に影響を及ぼすのと同様に、プロモーターから十分な距離を置いて配置する必要があります。これは、ポジティブコントロール（完全プロモーター）を用いて検証できます。
  6. 様々なプロモーター：レポーターコンストラクトを用いて、目的の細胞を形質転換します。プロモーターとレポーターコンストラクトをプラスミドにライゲーションし、そのプラスミドを発現できる細胞に形質転換することで、各プロモーター配列の活性を測定します。プロモーターに作用するタンパク質も細胞に添加する必要があります。多くの場合、これらのタンパク質は恒常活性プロモーターの制御下にある同一または異なるプラスミド上に配置されます。
  7. レポーター遺伝子の転写速度を測定します。遺伝子産物をアッセイし、レポーター遺伝子の転写速度を測定します。

異なるプロモーターをアッセイして得られたデータから、プロモーターの様々な部分の影響を解明することができます。ただし、十分なデータが得られず、異なるプロモーター領域や異なる変異を用いてアッセイを再実行する必要がある場合もあります。

参照

参考文献

  1. ^ Kamvysselis, M. (2003).計算分子ゲノミクス：遺伝子、制御、進化. (博士論文). http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html より取得
  2. ^ Chalfie, M., & Kain, S. (2005)生物学的分析法、緑色蛍光タンパク質：特性、応用、およびプロトコル。Wiley。
  3. ^ Matsukura, S., Stellato, C., Plitt, JR, Bickel, C., Miura, K., Georas, SN, Casolaro, V., Schleimer, RP (1999). 「ヒト気道上皮細胞におけるNF-κBおよびSTAT6によるエオタキシン遺伝子転写の活性化」. J Immunol 163:6876-6883. PMID 10586089.
  4. ^ Engstrom, EM, Izhaki, A., Bowman, JL (2004). 「プロモーターバッシング、マイクロRNA、そしてKnox遺伝子。アラビドプシスにおける側方器官極性の確立における新たな知見、調節因子、そして調節標的。」Plant Phisiol 135(2): 685-94. doi : 10.1104/pp.104.040394. PMID 15208415. PMC 514105.
  5. ^ Guo、JY、Xu、J.、Mao、DQ、Fu、LL、Gu、JR、Zhu、JD (2002)。 「新規染色体17p13.3遺伝子であるヒトC17orf25遺伝子のプロモーター解析」。細胞研究12:339-352。土井：10.1038/sj.cr.7290136。
  6. ^ Boulin, T. et al. Reporter gene fusions (2006年4月5日)、WormBook、編集. The C. elegans Research Community、WormBook、doi 10.1895/wormbook.1.106.1、http://www.wormbook.org。
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