全反射顕微鏡

プローブ粒子によるエバネッセント場の散乱。

全反射顕微鏡法は、誘電体界面近傍のエバネッセント場からの散乱光を利用して物体の追跡・検出を行う特殊な光学イメージング技術です。その利点は、高い信号対雑音比と垂直方向における高い空間分解能です。

背景

光の全反射は、屈折率の異なる物質間の界面において、臨界角,より大きい入射角で発生する。ここで、 ${\displaystyle \theta_{c}}$

${\displaystyle \theta_{c}=\sin^{-1}(n_{2}/n_{1})}$

は入射媒体の屈折率と透過媒体の屈折率であり、界面の法線から測定されます。 ${\displaystyle n_{1}}$ ${\displaystyle n_{2}}$ ${\displaystyle \theta_{c}}$

全反射の条件下では、伝送媒体内の電磁場はエバネッセント波の形をとり、その強度は界面からの距離に応じて指数関数的に減少し、 ${\displaystyle I(z)}$

${\displaystyle I(z)=I_{0}e^{-\beta z}}$

と仮定する。実用上、伝送媒体としては、微小物体を浸漬できる流体（通常は水）が選ばれることが多い。物体を界面に近づけると、その高さにおける電界の強度に比例した光を散乱することが予想される。^[1] エバネッセント場の浸透深度は数百ナノメートル程度であるため、この手法は表面に対して垂直な方向の変位を追跡する上で最も感度の高い手法の一つである。^[2]${\displaystyle \beta ={\frac {4\pi }{\lambda }}{\sqrt {(n_{1}\sin(\theta ))^{2}-n_{2}^{2}}}}$ ${\displaystyle z}$

アプリケーション

イメージング

エバネッセント場の薄い励起領域は、高いS/N比で選択したサンプル領域の広視野イメージングを可能にします。しかしながら、生物学的応用においては、光散乱に頼るのではなく、より選択的な可視化のためにサンプルに蛍光体を導入することがよくあります。この一般的なイメージング技術は、全反射蛍光顕微鏡法として知られています。

粒子追跡

較正されたエバネッセント波^{[1]を用いることで、}フラストレート全反射による散乱光の強度をモニタリングすることで、コロイド粒子または微小プローブの位置をナノメートル単位の精度で追跡することができます。これにより、熱平衡状態または非平衡状態におけるプローブまたは粒子の詳細なダイナミクスが得られます。

例えば、熱平衡状態にあるプローブ粒子の時間に依存しない位置確率分布を収集し、マクスウェル・ボルツマン分布を反転させることにより、

${\displaystyle p(z)={\frac {1}{Z}}e^{-{\frac {V(z)}{kT}}}}$ 、

ここで、は分配関数、ボルツマン定数であり、粒子と表面との間の相互作用のポテンシャルエネルギープロファイルを得ることができる。^[3] このようにして、サブピコニュートンの力を検出することができる。^[4]${\displaystyle Z}$ ${\displaystyle k}$

一方、細胞やコロイドの拡散ダイナミクスは、TIRMやその他の粒子追跡法によって得られた位置の時系列から推定することができます。固体界面近傍における粒子の拡散を減少させる流体力学的結合効果は、この方法で研究されてきました。 ^[5]

参照

• 暗視野顕微鏡
• エバネッセント波
• 全反射
• 全反射蛍光顕微鏡

参考文献

1. Prieve, Dennis C., Nasser A. Frej. 「全反射顕微鏡法：コロイド力の測定のための定量的ツール」Langmuir 6.2 (1990): 396-403.
2. Prieve, Dennis C.「TIRMによるコロイド力の測定」コロイドおよび界面科学の進歩82.1（1999）：93-125。
3. Walz, John Y.「全反射顕微鏡による粒子相互作用の測定」コロイドと界面科学の最新見解2.6（1997）：600-606。
4. フリッカー、スコット・G、ジェニファー・L・ティパ、ステイシー・G・バイク。「全反射顕微鏡を用いたコロイド球とガラス板間の二重層反発の定量化」コロイド・インターフェース・サイエンス誌158.2（1993年）：317-325。
5. ベヴァン、マイケル・A.、デニス・C.・プリーブ「壁面近傍におけるコロイド粒子の妨害拡散：再考」『化学物理学ジャーナル』113.3 (2000): 1228-1236.