RT-PCR

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、RNAからDNA（この文脈では相補DNAまたはcDNAと呼ばれる）への逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた特定のDNA標的の増幅を組み合わせた実験技術です。[1]主に特定のRNAの量を測定するために使用されます。これは、リアルタイムPCRまたは定量PCR（qPCR）と呼ばれる技術を用いて、蛍光を用いて増幅反応をモニタリングすることによって達成されます。RT-PCRとqPCRの組み合わせは、研究および臨床現場における 遺伝子発現の分析やウイルスRNAの定量化に日常的に使用されています。

RT-PCRとqPCRの密接な関連性により、qPCRという用語がRT-PCRを意味する換喩的に使用されるようになりました。このような使用は混乱を招く可能性があります。 [2] RT-PCRはqPCRなしで、例えば分子クローニング、シークエンシング、またはRNAの単純な検出を可能にするために使用できるためです。逆に、qPCRはRT-PCRなしで、例えば特定のDNA片の コピー数を定量するために使用される場合があります

命名法

RT-PCRとqPCRを組み合わせた技術は、定量RT-PCR [3]またはリアルタイムRT-PCR [4]（定量リアルタイムRT-PCR [5] と呼ばれることもある）と呼ばれ、qRT-PCR [6 ]、 RT-qPCR [7] 、RRT- PCR [8] 、 rRT-PCR [ 9 ]などと略されて呼ばれてきました。混乱を避けるため、この記事では一貫して以下の略語を使用します。

すべての著者、特に初期の著者がこの表記法を使用しているわけではないため、読者はリンクをたどる際には注意が必要です。RT-PCRは、リアルタイムPCR（qPCR）と逆転写PCR（RT-PCR）の両方を示すために使用されてきました。

歴史

1977年の導入以来、ノーザンブロット法は、(a)時間のかかる手法、(b)検出に大量のRNAが必要、(c)RNA含有量が少ないため定量的に不正確であるといった欠点があるにもかかわらず、RNA定量に広く使用されてきました。[10] [11]しかし、 1983年にKary MullisによってPCRが発明されて以来、RNAの検出と定量のための選択肢として、RT PCRがノーザンブロット法に取って代わりました。[12]

RT-PCRは、RNAレベルの検出および／または比較におけるベンチマーク技術として、いくつかの理由から注目を集めています。(a)PCR後の処理が不要、(b)広範囲（10倍以上）のRNA量を測定可能、(c)定性的データと定量的データの両方に対する洞察が得られる、といった理由です。[5]そのシンプルさ、特異性、感度により、RT-PCRは、ワイン中の酵母細胞の定量化のような単純な実験から、鳥インフルエンザウイルスやSARS-CoV-2などの感染性病原体を検出するための診断ツールとしてのより複雑な用途まで、幅広い用途に使用されています。[13] [14] [15]

原則

RT-PCRでは、まず逆転写酵素（RT）を用いてRNAテンプレートを相補DNA（cDNA）に変換します。次に、このcDNAをPCRによる指数関数的増幅のテンプレートとして使用します。RNA転写産物の検出にRT-PCRを使用することで、遺伝子発現の研究​​は次のような重要な点で革命的な変化を遂げました。

  • 実質的にあらゆる遺伝子の転写産物を検出することが理論的に可能になりました[16]
  • サンプルの増幅が可能になり、ノーザンブロット分析に必要な大量の出発物質が不要になりました[17] [18]
  • プライマーにまたがるRNAが損傷していない限り、RNAの分解に対する耐性を提供します[17]

ワンステップRT-PCRとツーステップRT-PCR

ワンステップRT-PCRとツーステップRT-PCR

RT-PCRを用いたmRNAの定量は、ワンステップ反応またはツーステップ反応のいずれかで行うことができます。2つのアプローチの違いは、手順を実行する際に使用するチューブの数にあります。ツーステップ反応では、逆転写酵素反応とPCR増幅を別々のチューブで行う必要があります。ツーステップアプローチの欠点は、サンプルの取り扱い頻度が高くなるため、コンタミネーションの影響を受けやすいことです。[19] 一方、ワンステップアプローチでは、cDNA合成からPCR増幅までの反応全体が1本のチューブで行われます。ワンステップアプローチは、すべての酵素反応を単一の環境に含めることで、実験のばらつきを最小限に抑えると考えられています。労力がかかり、コンタミネーションが発生しやすいcDNA産物をPCR反応にピペッティングする手順が不要になります阻害剤耐性の耐熱性DNAポリメラーゼ、つまり最適化されたワンステップRT-PCR条件を備えたポリメラーゼエンハンサーのさらなる使用は、全血や血清などの未精製または粗サンプルからのRNAの逆転写をサポートします。[20] [21]しかし、ワンステップアプローチでは開始RNAテンプレートが分解されやすいため、同じサンプルから繰り返しアッセイが必要な場合はこのアプローチの使用は推奨されません。さらに、ワンステップアプローチはツーステップアプローチに比べて精度が低いことが報告されています。また、SYBR GreenなどのDNA結合色素を使用する場合、プライマーダイマーの除去は融点の単純な変化によって達成できるため、ワンステップアプローチは好ましい分析方法でもあります。それでも、ワンステップアプローチは、バイオセンシングにおいて標的RNAを直接迅速に検出するための比較的便利なソリューションです。[要出典]

エンドポイントRT-PCR vs リアルタイムRT-PCR

RT-PCR産物の定量は、エンドポイントとリアルタイムの2つのカテゴリーに大きく分けられます。[22]少数のサンプルにおける遺伝子発現変化の測定にはエンドポイントRT-PCRの使用が好まれますが、リアルタイムRT-PCRは、アレイ解析から得られた定量結果や世界規模での遺伝子発現変化を検証するためのゴールドスタンダード法となっています。[23]

エンドポイントRT-PCR

エンドポイントRT-PCRの測定法では、エチジウムブロマイドなどの蛍光色素[24] [25] 、ホスホイメージャーを用いたPCR産物のP32標識[26] 、またはシンチレーションカウンティング[ 18 ]による遺伝子発現レベルの検出が必要です。エンドポイントRT-PCRは、一般的に相対法、競合法、比較法の3つの異なる方法を用いて行われます。[27] [28]

相対RT-PCR
RT-PCRの相対定量では、目的遺伝子と同時に内部コントロールを増幅します。内部コントロールはサンプルを正規化するために使用されます。正規化されると、複数のmRNAサンプル間で相対的な転写産物量を直接比較できます。注意すべき点の1つは、内部コントロールは実験処理の影響を受けないように選択する必要があることです。結果が正確で有意義であるためには、発現レベルはすべてのサンプルおよび目的のmRNA間で一定である必要があります。結果の定量化は、標的とコントロールの増幅の直線範囲を比較することによって分析されるため、分析を開始する前に、開始時の標的分子の濃度とその増幅率を考慮することが重要です。分析結果は、遺伝子シグナルと内部コントロールシグナルの比として表され、これらの値は、相対的な標的RNA発現の推定においてサンプル間の比較に使用できます。[25] [28] [29]
競合RT-PCR
競合RT-PCR法は絶対定量に用いられます。サイズまたは配列のわずかな違いによって標的RNAと区別できる合成「競合」RNAを使用します。正確な結果を得るには、合成RNAは標的RNAと配列が同一で、わずかに短いように設計することが重要です。設計・合成後、既知量の競合RNAを実験サンプルに加え、RT-PCRを用いて標的RNAと共増幅します。次に、競合RNAの濃度曲線を作成し、内因性転写産物から生成されたRT-PCRシグナルと比較することで、サンプル中に存在する標的RNAの量を決定します。[28] [30]
比較RT-PCR
比較RT-PCRは、標的RNAが無関係な配列の内部標準と単一の反応内で増幅試薬を競合するという点で、競合RT-PCRに類似しています。反応が完了すると、結果は外部標準曲線と比較され、標的RNA濃度が決定されます。相対定量法および競合定量法と比較して、比較RT-PCRは、研究者がパイロット実験を行う必要がないため、より便利な方法であると考えられています。相対RT-PCRでは、mRNAの指数関数的増幅範囲を事前に決定する必要があり、競合RT-PCRでは合成競合RNAを合成する必要があります。[28] [31] [32] [33] [34]

リアルタイムRT-PCR

ここ数年で新しい蛍光DNA標識技術が登場し、PCR産物をリアルタイムで分析および検出できるようになり、その結果、遺伝子発現の解析にリアルタイムRT-PCRが広く採用されるようになりました[35]リアルタイムRT-PCRは現在、遺伝子発現の定量化に最適な方法であるだけでなく、アレイ解析や遺伝子発現から地球規模で結果を得るための好ましい方法でもあります。[36]現在、 PCR産物のリアルタイムRT-PCR検出には、SYBR Green、TaqMan、分子ビーコン、スコーピオンプローブの4種類の蛍光DNAプローブが利用可能です。これらのプローブはすべて、蛍光シグナルを生成することでPCR産物の検出を可能にします。SYBR Green色素は溶液中の二本鎖DNAに結合するだけで蛍光シグナルを発しますが、TaqManプローブ、分子ビーコン、スコーピオンプローブの蛍光生成は、色素分子とクエンチャー部分がオリゴヌクレオチド基質にフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）結合することに依存しています。 [37]

SYBR Green
SYBR GreenがPCR産物の二本鎖DNAに結合すると、励起により光を発します。PCR産物が蓄積するにつれて蛍光の強度が増加します。この技術は、結合特異性がないためプローブの設計が不要で、使いやすいです。しかし、この色素は二本鎖DNAとPCR産物、そしてプライマーダイマーからの二本鎖DNAを区別しないため、標的濃度の過大評価がよく発生します。正確な定量が絶対に必要な場合は、結果の検証のために追加のアッセイを行う必要があります。それでもなお、リアルタイムRT-PCR産物検出法の中で、SYBR Greenは最も経済的で使いやすい方法です。[22] [23]
TaqManプローブ
TaqManプローブ
TaqManプローブは、5'末端に蛍光プローブ、3'末端にクエンチャーが結合したオリゴヌクレオチドです。PCR増幅中、これらのプローブはアンプリコン内の標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼがTaqManが結合したテンプレートを複製する際に、ポリメラーゼ5'ヌクレアーゼ活性によって蛍光プローブも切断されます。クエンチ分子と蛍光プローブが近接しているため、通常、FRETによる蛍光の検出は妨げられますが、この分離により、プローブ切断サイクル数に比例して蛍光強度が増加します。適切に設計されたTaqManプローブは正確なリアルタイムRT-PCR結果をもたらしますが、分析するmRNA標的ごとに個別のプローブを作成する必要がある場合、合成には費用と時間がかかります。[22] [16] [38]さらに、これらのプローブは光に敏感であるため、分解を防ぐためにアリコートとして慎重に凍結する必要があります。
分子ビーコンプローブ
TaqManプローブと同様に、分子ビーコンもオリゴヌクレオチド基質の5'末端に蛍光プローブ、3'末端にクエンチャーを結合させたFRET検出法を利用します。しかし、TaqMan蛍光プローブは増幅中に切断されるのに対し、分子ビーコンプローブはそのまま残り、各反応サイクル中に新しい標的に再結合します。溶液中で遊離している状態では、蛍光プローブとクエンチャー分子が近接しているため、FRETによる蛍光は防止されます。しかし、分子ビーコンプローブが標的にハイブリダイズすると、蛍光色素とクエンチャーが分離され、励起時に光が放出されます。TaqManプローブと同様に、分子ビーコンの合成にはコストがかかり、RNA標的ごとに別々のプローブが必要です。[19]
スコーピオンプローブ
スコーピオンプローブは、分子ビーコンと同様に、ハイブリダイズしていない状態では蛍光活性を示しません。これは、5'末端の蛍光プローブがオリゴヌクレオチドの3'末端の分子によって消光されるためです。しかし、スコーピオンプローブの場合、3'末端には5'末端のプライマーの伸長産物と相補的な配列も含まれています。スコーピオン伸長産物がアンプリコン上の相補鎖に結合すると、スコーピオン構造が開き、FRETを阻害し、蛍光シグナルの測定が可能になります。[39]
マルチプレックスプローブ
TaqManプローブ、分子ビーコン、スコーピオンは、1本のチューブでPCR産物を同時に測定することを可能にします。これは、それぞれの異なる蛍光色素を特定の発光スペクトルに関連付けることができるためです。マルチプレックスプローブの使用は、検査の有用性を損なうことなく時間と労力を節約するだけでなく、遺伝子欠失解析、変異および多型解析、定量解析、RNA検出など、幅広い研究分野への応用により、多くの分野の研究室にとって非常に貴重な技術となっています。[39] [40] [41]

リアルタイムRT-PCRで得られた結果を定量化するために、標準曲線法と比較閾値法という2つの戦略が一般的に用いられています。[42]

応用

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による指数関数的増幅は、非常に低いコピー数のRNA分子を検出できる高感度技術を提供します。RT-PCRは、遺伝性疾患の診断や、遺伝子発現の指標として細胞または組織内の特定の異なるRNA分子の存在量の半定量的測定に広く使用されています。

研究方法

RT-PCRは、遺伝子発現を測定する研究方法で一般的に使用されています。例えば、LinらはqRT-PCRを用いて酵母細胞におけるGal遺伝子の発現を測定しました。まず、LinらはGal遺伝子の調節に関与していると疑われるタンパク質の変異を作成しました。この変異は、Gal発現を選択的に阻害すると仮定されました。これを確認するために、この変異を含む酵母細胞の遺伝子発現レベルをqRT-PCRを用いて分析しました。研究者らは、この調節タンパク質の変異がGal発現を低下させたことを決定的に判断することができました。[43] ノーザンブロット分析は、RNAの遺伝子発現をさらに研究するために使用されます。

遺伝子挿入

RT-PCRは、真核生物遺伝子を原核生物に挿入する際にも非常に有用です。ほとんどの真核生物遺伝子は、ゲノムには存在するが成熟mRNAには存在しないイントロンを含むため、RT-PCR反応から生成されるcDNAは、転写後に直接タンパク質に翻訳される正確なDNA配列です（逆転写酵素のエラーを起こしやすい性質を考慮に入れずに）。これらの遺伝子がタンパク質の生産または精製のために原核細胞で発現される場合、転写産物にはエクソンのみが含まれるため、転写から直接生成されたRNAはスプライシングを受ける必要がありません。（大腸菌などの原核生物は、真核生物のようなmRNAスプライシング機構を欠いています）。

遺伝性疾患診断

RT-PCRは、レッシュ・ナイハン症候群などの遺伝性疾患の診断に使用できます。この遺伝性疾患はHPRT1遺伝子の機能不全によって引き起こされ、臨床的には致命的な尿酸尿路結石と痛風に似た症状を引き起こします。[6] [説明が必要]妊娠中の母親と胎児のHPRT1 mRNA発現レベルを分析することで、母親が保因者であるかどうか、胎児がレッシュ・ナイハン症候群を発症する可能性が高いかどうかが明らかになります。[44]

がん検出

科学者たちは、予後の改善と治療への反応のモニタリングを支援するために、がん検出にRT-PCRを使用する方法に取り組んでいます。循環腫瘍細胞は、がんの種類に応じて固有のmRNA転写産物を生成します。目標は、特定のがん細胞の種類に最適なバイオマーカーとして機能するmRNA転写産物を特定し、RT-PCRでその発現レベルを分析することです。[45]

RT-PCRは、インフルエンザウイルスA、HIVやSARS-CoV-2などのレトロウイルスなど、ゲノムがRNAで構成されているウイルスのゲノム研究に一般的に使用されています。[46]

病原体検出

PCR検査は、宿主が抗体を産生し始める前であっても、病原体のDNAを増幅することにより、DNAベースの病原体を早期に検出するために使用できます。 [ 47] RT-PCRにより、このプロセスをRNAウイルスに適用できます。[36] RT-PCR検査はCOVID-19検査での使用で最もよく知られていますが[48] 、エボラ出血熱、ジカウイルス、MERS、SARS、インフルエンザなどの疾患の診断にも使用されています。[36] [48]

課題

RT-PCRには大きな利点があるものの、欠点がないわけではありません。PCRの複数サイクル中に逆転写された相補的DNA （cDNA）が指数関数的に増加すると、直線性を維持するのが難しくなり、エンドポイントの定量が不正確になります。 [49]サンプル中のRNA含有量を正確に検出して定量するために、PCRの各サイクル中に増幅産物をモニターするために蛍光ベースの修飾を使用するqRT-PCRが開発されました。この技術の極めて感度が高いことは、ごくわずかなDNA汚染でも望ましくない結果につながる可能性があるため、諸刃の剣になる可能性があります。[50]偽陽性の結果を排除する簡単な方法は、遺伝子特異的プライマーの5 '領域にアンカーまたはタグを含めることです。 [51]さらに、テンプレート濃度や増幅効率など、さまざまな変動源が存在するため、定量研究の計画と設計は技術的に困難な場合があります。[31]既知量のRNAをサンプルに添加し、一連のRNA希釈系列を加えて標準曲線を作成し、テンプレートコピーなしのサンプル（cDNAなし）をコントロールとして添加することができます。

プロトコル

RT-PCRは、ワンステップRT-PCRプロトコルまたはツーステップRT-PCRプロトコルによって実行できます

ワンステップRT-PCR

ワンステップRT-PCRは、mRNAターゲット（最大6kb）を逆転写し、1本の試験管内でPCR増幅を行います。無傷で高品質なRNAと配列特異的なプライマーを使用することで、最良の結果が得られます

逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ、プルーフリーディングポリメラーゼを配合したワンステップRT-PCRキットを選択し、必要な材料と器具をすべて揃えたら、反応混合物を調製します。反応混合物には、dNTP、プライマー、鋳型RNA、必要な酵素、緩衝液が含まれます。各反応ごとに反応混合物をPCRチューブに加え、続いて鋳型RNAを加えます。PCRチューブをサーマルサイクラーにセットしてサイクルを開始します。最初のサイクルではcDNAの合成が行われます。2番目のサイクルは、逆転写酵素を不活性化する最初の変性です。残りの40～50サイクルは増幅で、変性​​、アニーリング、伸長が含まれます。増幅が完了すると、RT-PCR産物はゲル電気泳動で分析できます。[52] [53]

ツーステップRT-PCR

2ステップRT-PCRは、その名の通り、2つのステップで行われます。まず逆転写、次にPCRです。この方法は1ステップ法よりも感度が高いです。2ステップRT-PCRにもキットが役立ちます。1ステップPCRと同様に、最良の結果を得るには、損傷のない高品質のRNAのみを使用してください。2ステップPCRのプライマーは、配列特異的である必要はありません。

ステップ1

まず、PCRチューブに鋳型RNA、プライマー、dNTPミックス、ヌクレアーゼフリー水を混ぜます。次に、PCRチューブにRNase阻害剤と逆転写酵素を加えます。次に、PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、アニーリング、伸長、逆転写酵素の不活性化を1サイクル行います。最後に、ステップ2のPCRに直接進むか、PCRを実行できるまで産物を氷上で保管します。

ステップ2

バッファー、dNTPミックス、MgCl 2、Taqポリメラーゼ、ヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを各PCRチューブに加えます。次に、必要なプライマーをチューブに加えます。次に、PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、増幅プログラムを30サイクル実行します。これには、変性、アニーリング、伸長が含まれます。RT-PCRの産物はゲル電気泳動で分析できます。[54]

出版ガイドライン

定量的RT-PCRアッセイは、サンプル中の特定のcDNA標的のコピー数を測定するためのゴールドスタンダードと考えられていますが、標準化が不十分です。[55]その結果、この技術を用いた論文は数多くありますが、その多くは実験の詳細が不十分で、不適切なデータ分析を用いて不適切な結論を導き出しています。定量的PCRデータの品質には固有のばらつきがあるため、査読者はこれらの論文の評価に苦労するだけでなく、研究の再現も不可能になります。[56]実験条件の報告の標準化の必要性を認識し、スティーブン・バスティン教授、マイケル・ファッフル教授、ミカエル・クビスタ教授を含む国際的な学術科学者コンソーシアムによって、定量的リアルタイムPCR実験の出版のための最小情報（MIQE、発音は「マイキー」）ガイドラインが出版されましたMIQEガイドラインは、より良い実験実践を奨励し、定量PCRデータの関連性、正確性、正しい解釈、再現性を確保するために出版に求められるべき定量PCR実験の評価に必要な最小限の情報について説明しています。[57]

MIQEは、報告ガイドラインに加えて、混乱を避けるために定量PCRに関連する命名法を標準化する必要性を強調しています。たとえば、定量リアルタイムPCRにはqPCRの略語を使用し、逆転写qPCRにはRT-qPCRを使用する必要があります。また、正規化に使用される遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子ではなく参照遺伝子と呼ばれる必要があります。また、 TaqManプローブなどの商業的に由来する用語は使用せず、代わりに加水分解プローブと呼ぶことを提案しています。さらに、定量に使用されるPCRサイクルを記述するために、同じ値を指しますが、リアルタイム機器の異なるメーカーによって造られた閾値サイクル（Ct）、交差ポイント（Cp）、およびテイクオフポイント（TOP）ではなく、定量サイクル（Cq）を使用することが提案されています。 [ 55]

このガイドラインは、以下の要素で構成されています。1) 実験設計、2) サンプル、3) 核酸抽出、4) 逆転写、5) qPCRターゲット情報、6) オリゴヌクレオチド、7) プロトコル、8) 検証、9) データ分析。各要素内の特定の項目には、E（必須）またはD（望ましい）のラベルが付けられています。Eとラベル付けされたものは重要かつ不可欠であると考えられており、Dとラベル付けされたものは周辺的ではあるがベストプラクティスにとって重要であると考えられています。[57]

RT-qPCRとMIQEガイドラインの使用に関する会議やコースは、ミュンヘン工科大学のマイケル・ファッフル教授、チェコ科学アカデミーバイオテクノロジー研究所のミカエル・クビスタ教授、ハイデルベルクの欧州分子生物学研究所（EMBL）のウラジミール・ベネス教授、ロンドンのアングリア・ラスキン大学のスティーブン・バスティン教授によって定期的に開催されています。彼らは協力して、ケア・エクイティによる買収後に TATAAバイオセンターでのコースが中止された後、スウェーデンのヨーテボリにあるGoCoヘルスイノベーションシティのPrecision BioAnalyticsでのトレーニングをサポートしています。

研究

2023年、研究者たちはRT-LAMPラボオンチップシステムの実用的なプロトタイプを開発し、SARS-CoV-2検査の結果を3分以内に提供しました。この技術は、マイクロ流体チャネルをプリント回路基板に統合することで、低コストの大量生産を可能にする可能性があります。[58] [59]

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  • qPCRのリファレンス - 学術・産業情報プラットフォーム
  • ムンバイの政府系RT-PCRセンター トップ5 2021年7月11日アーカイブ - Wayback Machine