SEMで撮影した花粉粒の画像は、 SEM顕微鏡写真の特徴的な被写界深度を示しています。
M.フォン・アルデンヌの最初のSEM
試料室を開いたSEM
アナログ型SEM

走査型電子顕微鏡( SEM ) は、集束した電子ビームで表面を走査することで試料の画像を作成する電子顕微鏡の一種です。電子は試料内の原子と相互作用し、表面の地形や組成に関する情報を含むさまざまな信号を生成します。電子ビームはラスタースキャンパターンで走査され、ビームの位置と検出された信号の強度が組み合わされて画像が作成されます。最も一般的な SEM モードでは、電子ビームによって励起された原子から放出された二次電子は、二次電子検出器 (エバーハート・ソーンリー検出器) を使用して検出されます。検出できる二次電子の数、つまり信号強度は、特に試料の地形に依存します。一部の SEM は 1ナノメートルを超える解像度を実現できます。

試料は、従来のSEMでは高真空下で観察されるか、可変圧力SEMや環境SEMでは低真空または湿潤状態で観察され、特殊な機器では広範囲の極低温または高温下で観察されます。[1]

歴史

走査型電子顕微鏡の初期の歴史については、マクマランが解説している。[2] [3]マックス・ノールは電子ビームスキャナを用いてチャネリングコントラストを示す物体視野幅 50 mm の写真を作成したが、 [4]縮小して細かく焦点を絞った電子ビームで非常に小さなラスター走査を行う高解像度の顕微鏡を1937 年に発明したのはマンフレート・フォン・アルデンヌであった[5]。同年、セシル・E・ホールも、トロント大学の上司である E・F・バートンから課題を与えられてわずか 2 年後に、北米初のエミッション顕微鏡の構築を完了した[6] 。アルデンヌは、透過型電子顕微鏡(TEM)の解像度を超え、 TEM での実際の画像化につきものの色収差に関する重大な問題を軽減するために、電子ビームの走査を適用した。彼はさらに、SEM のさまざまな検出モード、可能性、理論について論じ、[7] [8]ズヴォルキンのグループによってさらなる研究が報告され、[9] 1950年代から1960年代初頭にかけてチャールズ・オートリーが率いるケンブリッジのグループによっても報告され、 [10] [11] [12] [13]最終的に、1965年にケンブリッジ・サイエンティフィック・インストゥルメント社によって「ステレオスキャン」という名前で最初の商用機器が販売され、デュポン社に納入されました。

原則と能力

ショットキーエミッタ電子源
電子と物質の相互作用量と生成される信号の種類

SEMが画像を作成するために用いる信号は、試料内の様々な深さにおける電子ビームと原子との相互作用から生じます。生成される信号には、二次電子（SE）、反射電子または後方散乱電子（BSE）、特性X線および特性光（カソードルミネッセンス）（CL）、吸収電流（試料電流）、透過電子など、様々な種類があります。二次電子検出器はすべてのSEMに標準装備されていますが、他のすべての信号に対応する検出器が1台の装置に搭載されていることは稀です。[要出典]

二次電子のエネルギーは 50 eV程度と非常に低く、固体内での平均自由行程が制限されます。そのため、SE はサンプル表面から数ナノメートルしか離れることができません。二次電子からの信号は、一次電子ビームの衝突点で高度に局所化される傾向があるため、 1 nm未満の解像度でサンプル表面の画像を収集することが可能です。後方散乱電子 (BSE) は、弾性散乱によってサンプルから反射されたビーム電子です。BSE は SE よりもはるかに高いエネルギーを持っているため、サンプル内のより深い場所から放出され、その結果、BSE 画像の解像度は SE 画像よりも低くなります。ただし、BSE 信号の強度はサンプルの原子番号 (Z) と強く関連しているため、BSE は特性 X 線から作成されたスペクトルとともに分析 SEM でよく使用されます。BSE 画像からは、サンプル内のさまざまな要素の分布に関する情報は得られますが、その同一性に関する情報は得られません。生物試料など、主に軽元素で構成される試料では、BSEイメージングにより、直径5nmまたは10nmのコロイド状金 免疫標識を画像化できます。これらの標識は、二次電子像では検出が困難または不可能です。 [14]特性X線は、電子ビームが試料から内殻電子を除去し、より高エネルギーの電子が内殻電子を満たしてエネルギーを放出するときに放出されます。これらの特性X線のエネルギーまたは波長は、エネルギー分散型X線分光法または波長分散型X線分光法によって測定でき、試料中の元素の同定と存在量の測定、および元素の分布マップの作成に使用されます。

SEM顕微鏡写真は、非常に細い電子ビームを用いることで、深い被写界深度を有し、特徴的な三次元像が得られるため、試料の表面構造を理解するのに役立ちます。[15]これは、上に示した花粉の顕微鏡写真によく示されています。約10倍（高性能手持ちレンズとほぼ同等）から、最高クラスの光学顕微鏡の限界倍率の約250倍に相当する50万倍以上まで、幅広い倍率が可能です。

サンプルの準備

SEMで観察できるように準備された、金でスパッタコーティングされたクモ
ポストイット上の粘着液滴の分布を低電圧顕微鏡（300 V）で撮影した写真。導電性コーティングは施されていない。コーティングを施すと、この脆弱な試料は変化してしまうためである。

SEM試料は試料台に収まる程度の大きさでなければならず、高真空条件と高エネルギー電子ビームに耐えられるように、導電性を高め安定化させるための特別な前処理が必要となる場合がある。試料は通常、導電性接着剤を用いて試料ホルダーまたはスタブに固定される。SEMは半導体ウェハの欠陥分析に広く用いられており、メーカーは300mmの半導体ウェハのあらゆる部分を検査できる装置を製造している。多くの装置には、そのサイズの物体を45°傾斜させ、360°連続回転させることができるチャンバーが搭載されている。[要出典]

非導電性の試料は、電子ビームによる走査時に電荷を蓄積し、特に二次電子イメージングモードでは、走査不良やその他の画像アーティファクトの原因となります。 SEM での従来のイメージングでは、試料は少なくとも表面が導電性で、静電荷の蓄積を防ぐために電気的に接地されている必要があります。金属物体は、洗浄と試料スタブへの導電マウントを除いて、SEM 用の特別な準備はほとんど必要ありません。 非導電性材料は通常、低真空スパッタコーティング、無電解メッキ[要出典]、または高真空蒸着によって試料上に堆積された導電性材料の極薄コーティングでコーティングされます。現在試料コーティングに使用されている導電性材料には、金、金/パラジウム合金、白金、イリジウム、タングステン、クロム、オスミウム[14]、グラファイトなどがあります。この改善は、高Z材料の二次電子放出が強化されることによって生じます。[要出典]

いくつかの生物学的サンプルに対するコーティングの代替法としては、OTO染色法（O-四酸化オスミウム、T-チオカルボヒドラジド、O-オスミウム）の変種を用いてオスミウムを含浸させることで材料のバルク導電性を高める方法がある。[16] [17]

非導電性試料は、環境SEM（ESEM）または低電圧SEM動作モードを用いることで、コーティングなしで画像化できます。ESEM装置では、試料は比較的高圧のチャンバー内に配置され、電子光学カラムは差動排気され、電子銃付近の真空度が適切に低く保たれます。ESEM内の試料周囲の高圧領域は電荷を中和し、二次電子信号を増幅します。[要出典]低電圧SEMは通常、低い加速電位でも高い一次電子輝度と小さなスポットサイズを生成できる電界放出電子銃（FEG）を備えた装置で実施されます。非導電性試料の帯電を防ぐため、入射ビーム電流が出射する二次電子電流と後方散乱電子電流の合計に等しくなるように動作条件を調整する必要があります。この条件は、加速電圧0.3～4 kVで最もよく満たされます。[要出典]

樹脂に埋め込み、さらに研磨して鏡面仕上げにしたものは、後方散乱電子でイメージングする場合や定量的 X 線マイクロ分析を行う場合に、生物試料と材料試料の両方に使用できます。

以下に概説する環境 SEM では主な準備手法は必要ありませんが、一部の生物標本では固定が効果的です。

生物学的サンプル

SEM試料室は高真空下にあるため、SEM試料は完全に乾燥しているか極低温で冷却されている必要がある。[18]木材、骨、羽毛、乾燥した昆虫、または貝殻（卵殻[19]を含む）などの硬くて乾燥した材料は、ほとんど処理をせずに検査できるが、生きた細胞や組織、および軟体生物全体は、その構造を保存および安定させるために化学的に固定する必要がある。

固定は通常、グルタルアルデヒドなどの緩衝化学固定液中でインキュベートすることによって行われますが、ホルムアルデヒド[18] [20] [21]や他の固定液[22]と組み合わせて使用​​される場合もあります。その後、必要に応じて四酸化オスミウムで後固定します。[18]固定された組織はその後脱水されます。空気乾燥は組織を崩壊させ収縮させるため、一般的には細胞内の水分をエタノールやアセトンなどの有機溶媒に置換し、これらの溶媒を臨界点乾燥によって液体二酸化炭素などの遷移流体に置換します。[23]二酸化炭素は最終的に超臨界状態で除去されるため、乾燥中にサンプル内に気液界面は存在しません。

乾燥標本は通常、エポキシ樹脂や導電性両面粘着テープなどの接着剤を用いて標本台に固定され、顕微鏡観察の前に金または金パラジウム合金でスパッタコーティングされます。生物の内部超微細構造に関する情報を画像化するために、 標本をミクロトームを用いて薄切することもあります。

SEMにクライオ顕微鏡用の冷却ステージが装備されている場合は、クライオ固定法を使用し、低温で固定された標本に対して低温走査型電子顕微鏡検査を行うことができます。[18]クライオ固定された標本は、内部構造を明らかにするために特殊な装置で真空下でクライオフラクチャリングされ、スパッタコーティングされて凍結したままSEMクライオステージに移されます。[24]低温走査型電子顕微鏡（LT-SEM）は、氷[25] [26]や脂肪[27]などの温度に敏感な材料の画像化にも適用できます。

フリーズフラクチャリング、フリーズエッチング、またはフリーズアンドブレイクは、脂質膜とそこに含まれるタンパク質を「正面」から観察するのに特に有用な試料作製法です。この試料作製法によって、脂質二重層に埋め込まれたタンパク質が明らかになります。

材料

試料の反射電子像（BSC）観察、定量X線分析、X線マッピングでは、表面を超平滑に研磨する必要があることがよくあります。WDS （波長分散型光電子分光）またはEDS（電子分光）分析に供される試料は、多くの場合カーボンコーティングされています。一般的に、金属は導電性があり、接地経路を自ら確保するため、SEMで観察する前にコーティングは行われません。フラクトグラフィは、光学顕微鏡、または一般的にはSEMで行われる破面の観察です。破面は適切なサイズに切断され、有機残留物を除去し、SEMで観察できるように試料ホルダーに取り付けます。集積回路は、集束イオンビーム（FIB）またはその他のイオンビームミリング装置で切断され、SEMで観察されます。前者の場合、SEMはFIBに組み込むことができ、処理結果を高解像度で観察できます。金属、地質学的試料、集積回路はすべて、SEMで観察するために化学研磨されることもあります。無機薄膜の高倍率画像化には特殊な高解像度コーティング技術が必要です。

スキャンプロセスと画像形成

SEMの概略図

典型的なSEMでは、タングステンフィラメントカソードを備えた電子銃から電子ビームが熱イオン化されて放出されます。タングステンは、あらゆる金属の中で最も融点が高く、蒸気圧が低いため、電気的に加熱して電子を放出することができ、また低コストであるため、熱イオン化電子銃によく使用されます。その他の種類の電子放出源としては、六ホウ化ランタン（LaB
6) カソードは、真空システムをアップグレードすれば標準的なタングステン フィラメント SEM で使用できます。また、電界放出銃 (FEG) には、タングステン単結晶エミッターを使用する冷陰極タイプや、酸化ジルコニウムでコーティングされたタングステン単結晶のエミッターを使用する熱アシストショットキータイプがあります。

電子ビームは通常0.2keVから40keVのエネルギー範囲にあり、1つまたは2つのコンデンサーレンズによって直径約0.4nmから5nmのスポットに集束されます。ビームは、電子カラム（通常は最終レンズ）内の一対の走査コイルまたは一対の偏向板を通過し、そこでX軸とY軸に偏向されます。これにより、ビームは試料表面の長方形領域を ラスター状に走査します。

試料原子からの二次電子、後方散乱電子、特性X線放出のメカニズム

一次電子ビームが試料と相互作用すると、試料の涙滴型の体積内で電子はランダムな散乱と吸収を繰り返すことでエネルギーを失います。この体積は、表面の 100 nm 未満から約 5 μm まで広がります。相互作用体積のサイズは、電子の着地エネルギー、試料の原子番号、および試料の密度によって決まります。電子ビームと試料間のエネルギー交換の結果、弾性散乱による高エネルギー電子の反射、非弾性散乱による二次電子の放出、および電磁放射線の放出が起こり、それぞれ専用の検出器で検出できます。試料に吸収されたビーム電流も検出でき、これを使用して試料電流の分布画像を作成できます。さまざまなタイプの電子増幅器を使用して信号を増幅し、コンピューター モニター (または、旧式モデルの場合はブラウン管)上に明るさの変化として表示します。コンピュータのビデオメモリの各ピクセルは、顕微鏡内の標本上のビームの位置と同期しており、その結果得られる画像は、標本の走査領域から放出される信号強度の分布図となります。古い顕微鏡はフィルムに画像を記録していましたが、現代の機器のほとんどはデジタル画像で収集します。

雪の結晶の低温SEM拡大シリーズ。結晶は極低温で捕獲・保管され、白金でスパッタコーティングされてから観察されます。

倍率

SEM の倍率は、約 10 倍から 3,000,000 倍まで、約 6桁の範囲で制御できます。 [28]光学電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡とは異なり、SEM の画像倍率は対物レンズのパワーの関数ではありません。SEMにはコンデンサーと対物レンズがありますが、その機能はビームを一点に焦点を合わせることであり、試料の画像化ではありません。電子銃が十分に小さい直径のビームを生成できる場合、SEM は原理的にはコンデンサーや対物レンズなしで完全に機能します。ただし、汎用性が高くなかったり、非常に高い解像度を達成できない場合があります。走査型プローブ顕微鏡と同様に、SEM では、倍率は表示装置上のラスターと試料上のラスターの寸法の比率によって決まります。表示画面のサイズが固定されていると仮定すると、試料上のラスターのサイズを小さくすると倍率が高くなり、その逆も同様です。したがって、倍率は対物レンズのパワーではなく、x、y スキャンコイルに供給される電流、または x、y 偏向板に供給される電圧によって制御されます。

二次電子の検出

最も一般的なイメージング モードは、ビーム電子との非弾性散乱相互作用によって試料原子の伝導帯または価電子帯から放出される低エネルギー (< 50 eV) の二次電子を収集します。これらの電子は低エネルギーであるため、試料表面から数ナノメートル以内の深さから発生します。 [15]電子は、コレクターシンチレーター光電子増倍管システムの一種であるEverhart–Thornley 検出器[29]によって検出されます。二次電子は、まず約 +400 V に電気的にバイアスされたグリッドに向かって引き寄せられて収集され、次に約 2-10 kV に正にバイアスされた蛍光体または薄いシンチレーターに向かってさらに加速されます。加速された二次電子は、シンチレーターから光のフラッシュ (カソードルミネッセンス) を放出するのに十分なエネルギーを持ちます。このフラッシュは、ライト パイプと試料室の壁にある窓を介して、SEM カラムの外側にある光電子増倍管に伝導されます。光電子増倍管によって増幅された電気信号出力は、2次元の強度分布として表示されます。この信号は、アナログビデオディスプレイで表示および撮影したり、アナログ-デジタル変換を施してデジタル画像として表示・保存したりできます。このプロセスは、ラスタースキャンされた一次ビームに基づいています。信号の明るさは、検出器に到達する二次電子の数に依存します。ビームが試料の表面に対して垂直に入射する場合、活性化領域はビームの軸を中心に均一になり、一定数の電子が試料内から「脱出」します。入射角が増加すると、相互作用体積が増加し、ビームの片側の「脱出」距離が短くなるため、試料から放出される二次電子の数が増えます。したがって、急勾配の表面やエッジは平坦な表面よりも明るくなる傾向があり、明瞭で立体的な画像が得られます。二次電子信号を用いることで、0.5 nm未満の 画像解像度が可能になります。

後方散乱電子の検出

SEM技術の比較：
上：反射電子分析 - 組成
下：二次電子分析 - 地形

後方散乱電子（BSE）は、電子ビームから発生する高エネルギー電子が試料原子との弾性散乱相互作用によって試料相互作用体積外に反射または後方散乱したものから構成されます。重元素（原子番号が大きい）は軽元素（原子番号が小さい）よりも電子を強く後方散乱するため、画像ではより明るく見えるため、BSEは化学組成の異なる領域間のコントラストを検出するために使用されます。[15]通常、試料の片側に配置されるエバーハート・ソーンリー検出器は、検出器の立体角内に放出される反射電子がほとんどなく、正バイアスされた検出グリッドが高エネルギーBSEを捕捉する能力がほとんどないため、後方散乱電子の検出には効率的ではありません。専用の後方散乱電子検出器は、電子ビームと同心円状に試料上に「ドーナツ」型に配置され、収集立体角を最大化します。BSE検出器は通常、シンチレータ型または半導体型のいずれかです。検出器のすべての部品をビームに対して対称的に電子を収集するために使用すると、原子番号コントラストが生成されます。一方、非対称で方向性のあるBSE検出器を使用して試料の片側から後方散乱電子を収集すると、強い地形コントラストが生成されます。その結果生じるコントラストは、その側からの地形の光として現れます。半導体検出器は放射状のセグメントに構成することができ、セグメントのオン/オフを切り替えることで、生成されるコントラストの種類と方向性を制御できます。

後方散乱電子は、試料の結晶構造を決定するために使用できる 電子後方散乱回折(EBSD) 画像を形成するためにも使用できます。

半導体のビーム注入分析

SEMのプローブである高エネルギー電子の性質は、半導体材料の光学特性と電子特性を調べるのに特に適しています。SEMビームから放出される高エネルギー電子は、半導体に電荷キャリアを注入します。その結果、ビーム電子は価電子帯から伝導帯へ電子を押し出すことでエネルギーを失い、正孔を残します。

直接バンドギャップ材料では、これらの電子-正孔対の再結合によりカソードルミネッセンスが発生します。試料にpn接合のような内部電界が存在する場合、SEMビームによるキャリアの注入により電子ビーム誘起電流（EBIC）が流れます。カソードルミネッセンスとEBICは「ビーム注入」技術と呼ばれ、半導体の光電子的挙動を調べるための非常に強力なプローブであり、特にナノスケールの特徴や欠陥の研究に有効です。

カソードルミネッセンス

InGaN多結晶のSEM像に重ね合わせたカラーカソードルミネッセンス画像。青と緑のチャンネルは実際の色を表し、赤のチャンネルは紫外線発光に対応しています。

カソードルミネッセンスは、高エネルギー電子によって励起された原子が基底状態に戻る際に放出される光で、紫外線誘起蛍光と類似しており、硫化亜鉛や一部の蛍光染料などの物質は両方の現象を示します。過去数十年にわたり、カソードルミネッセンスは、テレビやコンピューターのCRTモニターのブラウン管の内面から放出される光として最も一般的に認識されてきました。SEMでは、CL検出器が試料から放出されるすべての光を集光するか、試料から放出される波長を分析して、発光スペクトルまたは試料から放出されるカソードルミネッセンスの分布画像を実色で表示します。

X線マイクロアナリシス

電子と試料の相互作用によって生成される特性X線は、エネルギー分散型X線分光法または波長分散型X線分光法を備えた走査型電子顕微鏡（SEM）でも検出できます。X線信号の分析により、試料中の元素の分布をマッピングし、存在量を推定することができます。

補完的な技術

SEMをベースとした多くの研究は、原子間力顕微鏡（AFM）とその電気イメージングモードといった補完的なナノスケール技術によって支えられています。これらの手法は、表面形態にとどまらない知見をもたらします。例えば、AFMは、鋭い探針を接触モードまたはタッピングモードで用いることで、試料の表面形状をナノメートルスケールで探査することができます。導電性AFM（C-AFM）は局所的な電気伝導率のマッピングを可能にし、抵抗スイッチング材料や半導体の研究に役立ちます。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は表面電位の変化を測定し、電子材料や光起電材料の電荷分布の解析に役立ちます。SEMと併用することで、これらの技術は材料の構造特性と機能特性の両方を包括的に理解することを可能にします。

SEMの解像度

生物試料用に設計された走査型電子顕微鏡の典型的な実用倍率範囲を示すビデオです。ビデオは25倍（視野全体で約6mm）から始まり、12000倍（視野全体で約12μm）までズームインします 。球状の物体は直径10μmのガラスビーズで、赤血球とほぼ同じ直径です。

SEM はカメラではなく、検出器はCCDアレイやフィルムのように連続的に画像を形成しません。光学システムとは異なり、解像度は回折限界、レンズやミラーの精細さ、または検出器アレイの解像度によって制限されません。集束光学系は大きくて粗い場合があり、SE 検出器は拳サイズで電流を検出するだけです。その代わりに、SEM の空間解像度は電子スポットのサイズに依存し、電子スポットのサイズは電子の波長と走査ビームを生成する電子光学系の両方に依存します。解像度は相互作用体積のサイズ、つまり電子ビームと相互作用する試料材料の体積によっても制限されます。スポットサイズと相互作用体積はどちらも原子間の距離に比べて大きいため、SEM の解像度は透過型電子顕微鏡(TEM) のように個々の原子を画像化できるほど高くはありません。ただし、SEM には、試料の比較的広い領域を画像化できること、バルク材料 (薄膜や箔だけでなく) を画像化できることなど、それを補う利点があります。試料の組成や特性を測定するための多様な分析モードも利用可能である。機器によって分解能は1nm未満から20nmの範囲となる。2009年現在、世界最高分解能の従来型（30kV以下）SEMは、二次電子検出器を用いることで0.4nmの点分解能を達成している。[30]

環境SEM

従来のSEMでは、ガス雰囲気が急速に広がり電子線を減衰させるため、サンプルを真空状態で撮影する必要がある。その結果、湿った生物サンプルや石油含有岩石など、大量の蒸気を発生するサンプルは、乾燥させるか極低温で凍結する必要がある。接着剤の乾燥や合金の溶融、液体輸送、化学反応、固体-空気-ガス系などの相転移を伴うプロセスは、一般に従来の高真空SEMでは観察できない。環境SEM（ESEM）では、チャンバー内の空気は排気されるが、水蒸気は飽和圧力付近に保持され、残留圧力は比較的高いままである。これにより、水やその他の揮発性物質を含むサンプルの分析が可能になる。ESEMでは、生きた昆虫の観察が可能になっている。[31]

1980年代後半に初めて商用化されたESEM [32] [33]により、低圧ガス環境（例えば1～50 Torrまたは0.1～6.7 kPa）かつ高相対湿度（最大100%）下での試料観察が可能になった。これは、水蒸気存在下でも動作可能な二次電子検出器[34] [35]の開発と、電子ビームの進路上に差動排気機能を備えた圧力制限絞りを設け、電子銃とレンズ周辺の真空領域と試料室を分離することで可能になった。最初の商用ESEMは、1988年に米国のElectroScan社によって製造された。ElectroScan社は1996年にPhilips社（後に電子光学部門をFEI社に売却）に買収された。[36]

ESEMは、炭素や金によるコーティングが不要なため、非金属材料や生物材料に特に有用です。コーティングされていないプラスチックやエラストマー、そしてコーティングされていない生物試料も、日常的に検査できます。コーティングは元に戻すことが困難で、試料表面の微細な特徴を隠してしまう可能性があり、得られる結果の価値を低下させる可能性があるため、これは有用です。重金属コーティングではX線分析が困難であるため、従来のSEMでは炭素コーティングが日常的に使用されていますが、ESEMではコーティングされていない非導電性試料でもX線マイクロアナリシスを行うことができます。ただし、X線分析ではESEM特有のアーティファクトがいくつか生じます。刑事訴訟や民事訴訟における特殊な試料の電子顕微鏡検査では、複数の異なる専門家による法医学分析が繰り返し必要になる場合があり、ESEMは好ましい選択肢となる可能性があります。ESEMまたはその他の液相電子顕微鏡法を用いて、液中の試料を研究することも可能です。[37]

透過SEM

SEMは、薄い試料片の下に適切な検出器を設置するだけで透過モードでも使用できます。[38]検出器には、明視野用、暗視野用、そして中視野から高角環状暗視野用のセグメント検出器があります。機器の違いにもかかわらず、この技術は依然として走査透過電子顕微鏡（STEM）と呼ばれることがよくあります。

法医学におけるSEM

SEMは、法医学において珪藻類や銃弾の残渣といった微細な物体の拡大分析によく用いられます。SEMは試料に対して非破壊的な力であるため、試料を損傷することなく証拠を分析することができます。SEMは高エネルギー電子ビームを試料に照射しますが、試料は試料を変化・破壊することなく反射します。これは珪藻類の分析において非常に有効です。人が溺死すると、水を吸い込むことで水中に含まれる珪藻類が血流、脳、腎臓などに侵入します。体内のこれらの珪藻類はSEMで拡大観察することができ、珪藻の種類を特定することで、死因や死因の解明に役立ちます。SEMで生成された画像を用いることで、法医学者は珪藻の種類を比較し、人が死亡した水域を確認することができます。[39]

銃弾残留物（GSR）分析は様々な分析機器で行うことができますが[40] 、SEMは、後方散乱電子検出器、二次電子検出器、 X線検出器の3つの検出器を用いて、元素の種類（主に金属）を詳細に分析できるため、無機化合物の分析に広く用いられています。GSRは、犯罪現場、被害者、または銃撃犯から採取し、SEMで分析することができます。これにより、科学者は発砲された銃器との近接性や接触の有無を特定することができます。[40]

SEMの色

電子顕微鏡は本来、カラー画像を生成するものではありません。二次電子検出器は、電子ビームが(x, y)ピクセル位置に照射された短時間の間に検出器が受信した電子数に対応する単一の値をピクセルごとに生成します。各ピクセルにおいて、この単一の値はグレーレベルとして表され、モノクロ画像を形成します。[ 41]しかし、カラー電子顕微鏡画像を得るにはいくつかの方法があります。[42]

単一の検出器を使用した偽色

  • 平面の表面の組成画像（通常はBSE）について：

色を得る最も簡単な方法は、カラールックアップテーブルを用いて、各グレーレベルを任意の色に置き換えることです。この方法は擬似カラーイメージングと呼ばれ、類似した特性や組成を持つ試料の相を区別するのに役立ちます。[43]

  • テクスチャ表面画像の場合:

各グレーレベルを単純に色に置き換える代わりに、斜めビームで観察したサンプルを用いて近似的なトポグラフィー画像を作成することができます（詳細は「単一SEM画像からの測光3Dレンダリング」セクションを参照）。このトポグラフィーは、3Dレンダリングアルゴリズムによって処理され、より自然な表面テクスチャのレンダリングが可能になります。

  • 腎臓結石の表面
    腎臓結石の表面
  • 推定地形から色を再処理した後も同様
    推定地形から色を再処理した後も同様
  • 続成作用を受けたディスコースターのSEM画像
    続成作用を受けたディスコースターのSEM画像
  • 同様の色付け後の同じ画像
    同様の色付け後の同じ画像

SEM画像の色分け

公開されているSEM画像には、人工的に色付けされていることがよくあります。[43]これは、美的効果、構造の明確化、またはサンプルにリアルな外観を与えるために行われる場合があり、通常は標本に関する情報を追加するものではありません。[44]

着色は、写真編集ソフトウェアを使用して手動で行うことも、特徴検出やオブジェクト指向セグメンテーションを使用する専用ソフトウェアを使用して半自動的に行うこともできます。[45]

あるいは、 EDX、EBSD、ECCI、カソードルミネッセンスなどの他の検出器からの追加情報が利用可能な場合は、それらをカラーチャンネルとして統合して、単一の高解像度画像で豊富な材料情報を提供することができます。[46]

複数の電子検出器を使用して構築された色

いくつかの構成では、複数の検出器を使用することで、ピクセルごとにより多くの情報が収集されます。[47]

一般的な例として、二次電子検出器と反射電子検出器を重ね合わせ、それぞれの検出器で撮影された画像に色を割り当てます。[48] [49]結果として、成分の密度に応じた色の合成カラー画像が得られます。この方法は密度依存カラーSEM（DDC-SEM）として知られています。DDC-SEMによって生成された顕微鏡写真は、二次電子検出器によってよりよく捉えられる地形情報を保持し、反射電子検出器によって得られる密度情報と組み合わせます。[50] [51]

  • 心臓組織中の石灰化粒子のDDC-SEM - 信号1：SE
    心臓組織中の石灰化粒子のDDC-SEM - 信号1: SE
  • シグナル2：BSE
    シグナル2：BSE
  • 前の2つの画像から得られたカラー画像。心血管石灰化の密度依存カラー走査型電子顕微鏡（DDC-SEM）像。オレンジ色はリン酸カルシウム球状粒子（高密度物質）、緑色は細胞外マトリックス（低密度物質）を示している。
    前の2つの画像から得られたカラー画像。心血管石灰化の密度依存カラー走査型電子顕微鏡（DDC-SEM）像。オレンジ色はリン酸カルシウム球状粒子（高密度物質）、緑色は細胞外マトリックス（低密度物質）を示している。
  • 同じ研究をより広い視野で捉えたもので、人間の心血管組織の石灰化に関する研究の一部である。
    同じ研究をより広い視野で捉えたもので、人間の心血管組織の石灰化に関する研究の一部である。

生成された光子に基づく分析信号

試料から放出される光子のエネルギーを測定することは、分析能力を得るための一般的な方法です。例としては、元素分析で使用されるエネルギー分散型X線分光法（EDS）検出器や、地質学試料などの電子誘起発光の強度とスペクトルを分析するカソードルミネッセンス顕微鏡（CL）システムがあります。これらの検出器を使用するSEMシステムでは、これらの追加信号を色分けして単一のカラー画像に重ね合わせ、試料のさまざまな成分の分布の違いを明確に見て比較できるようにするのが一般的です。オプションで、標準の二次電子画像を1つまたは複数の組成チャネルと結合して、試料の構造と組成を比較することもできます。このような画像は、元の信号データの完全な整合性を維持しながら作成でき、いかなる形でも変更されません。

SEMにおける3D

SPMとは異なり、SEMは本来3D画像を提供するものではありません。しかし、SEMを用いて以下の様々な方法を用いることで3Dデータを取得することができます。

ステレオペアからの3D SEM再構成

  • 写真測量は、SEM画像に三次元情報をもたらす最も計量的に正確な方法です。[43]測光法（次段落）とは異なり、写真測量は三角測量法を用いて絶対高さを計算します。欠点は、最小限のテクスチャがある場合にのみ機能することと、2つの異なる角度から2枚の画像を取得する必要があるため、傾斜ステージの使用が必要になることです。（写真測量は、同じペアの左画像と右画像間の各ピクセルのずれ（または「視差」）を計算するソフトウェア操作です。この視差は、局所的な高さを反映しています。）
  • 縦軸に沿って傾斜させて作製した、1 mm未満の微小化石（オストラコーダ）のSEM立体ペア
    縦軸に沿って傾斜させて作製した、大きさ1 mm未満の微化石（オストラコーダ）のSEM立体ペア
  • この 2 つの SEM 画像から、写真測量法 (MountainsSEM ソフトウェアを使用、次の画像を参照) によって 3 次元が再構築され、さまざまな角度の一連の 3D 表現が作成され、GIF ファイルに組み立てられてこのアニメーションが生成されました。
    この 2 つの SEM 画像から、写真測量法 ( MountainsSEMソフトウェアを使用、次の画像を参照) によって 3 次元が再構築され、さまざまな角度の一連の 3D 表現が作成され、GIF ファイルに組み立てられてこのアニメーションが生成されました。
  • 表面粗さ計の校正に用いられる粗さ校正サンプル（Ra = 3 μm）の3D表面再構成。15°傾斜した2枚の走査型電子顕微鏡画像から構築。3Dモデル（右下）の計算には約1.5秒[52]かかり、算出されたRa粗さ値の誤差は0.5%未満である。
    表面粗さ計の校正に用いられる粗さ校正用サンプル（Ra = 3 μm）の3D表面再構成。15 °傾斜した2枚の走査型電子顕微鏡画像から再構成した。（左上）。3Dモデル（右下）の計算には約1.5秒かかり[52]、算出された粗さRa値の誤差は0.5%未満である。

「シェーディングからの形状」による4象限検出器からの測光3D SEM再構成

この方法では通常、4象限BSE検出器（メーカーによっては3セグメント検出器）を使用します。顕微鏡は同一試料の4枚の画像を同時に取得するため、試料を傾ける必要はありません。この方法では、試料の傾斜が許容範囲内である限り、計量的な3D寸法が得られます。[43]現在（2018年）、ほとんどのSEMメーカーは、このような内蔵型またはオプションの4象限BSE検出器と、リアルタイムで3D画像を計算する専用ソフトウェアを提供しています。[53]

他のアプローチでは、最適推定アルゴリズムのようなより洗練された（そして時にはGPUを集中的に使用する）方法を使用し、計算能力への高い要求を犠牲にしてはるかに 優れた結果をもたらします[54] 。

いずれの場合も、このアプローチは傾斜の積分によって機能するため、垂直方向の傾斜やオーバーハングは無視されます。例えば、球全体が平面上にある場合、上半球の一部が平面からわずかに突出しているように見えるため、球の頂点の高度が誤って算出されます。この効果の顕著性は、試料に対するBSE検出器の角度に依存しますが、これらの検出器は通常、電子ビームの周囲（かつ近傍）に設置されているため、この効果は非常に一般的です。

単一のSEM画像からの測光3Dレンダリング

この方法では、斜入射低角照明下で取得したSEM画像が必要です。グレーレベルを傾斜として解釈し、その傾斜を積分することで試料の地形を復元します。この方法は、視覚的な強調や物体の形状と位置の検出に有効ですが、写真測量法などの他の方法とは異なり、垂直方向の高さを校正することは通常できません。[43]

  • ハエの複眼表面の450倍のSEM画像
    ハエの複眼表面の450倍のSEM画像
  • 前の画像の詳細
    前の画像の詳細
  • シェーディングアルゴリズムからの形状を使用した以前のものからのSEM 3D再構築
    シェーディングアルゴリズムからの形状を使用した以前のものからのSEM 3D再構築
  • 前のものと同じですが、シェーディングアルゴリズムから形状を適用する前に照明を均一化します。
    前のものと同じですが、シェーディングアルゴリズムから形状を適用する前に照明を均一化します。

その他の3D SEM再構成

  • 電子-物質相互作用モデルを用いた逆再構成[55] [56]
  • 単一の2Dファイルを用いた多重解像度再構成：高品質な3D画像は、あらゆる多孔質媒体の複雑さを明らかにするための究極の解決策となる可能性がありますが、その取得にはコストと時間がかかります。一方、高品質な2D SEM画像は広く入手可能です。最近、2D画像を直接用いて3Dモデルを構築する、3段階、マルチスケール、マルチ解像度の新たな再構成手法が発表されました。シャノンエントロピーと条件付きシミュレーションに基づくこの手法は、利用可能なほとんどの静止材料に適用でき、わずかな薄片から様々な確率的3Dモデルを構築できます。[57] [58] [59]
  • イオンアブレーションSEM（IA-SEM）は、ガリウムの集束ビームを用いて試料表面を20ナノメートルずつ繰り返し研磨するナノスケール3Dイメージング法である。その後、各露出面をスキャンして3D画像を作成する。 [60] [61]

3D SEMの応用

応用例の一つとして、氷結晶の粗さ測定が挙げられます。この手法は、可変圧力環境SEMとSEMの3D機能を組み合わせることで、個々の氷結晶面の粗さを測定し、それをコンピュータモデルに変換し、さらに統計解析を行うことができます。[62] その他の測定には、フラクタル次元、金属の破面の検査、材料の特性評価、腐食測定、ナノスケールでの寸法測定（段差、体積、角度、平坦度、支持比、共平面性など）などがあります。[要出典]

SEMは美術品の保存修復専門家によって、亜鉛イオンと脂肪酸の複合体の形成など、経年劣化による絵画の表面安定性への脅威を識別するためにも使用されています。[63]法医学者はSEMを使用して美術品の贋作を検出します。

以下は SEM を使用して撮影した画像の例です。

  • ダイズシストセンチュウと卵の着色SEM画像。人工着色により、専門家以外の人でも顕微鏡写真で明らかになった構造や表面を観察し、理解しやすくなっています。
    ダイズシストセンチュウと卵の着色SEM画像。人工着色により、専門家以外の人でも顕微鏡写真で明らかになった構造や表面を観察し、理解しやすくなっています。
  • ナンキョクオキアミ（Euphausia superba）の複眼。SEM像は焦点深度が深いため、節足動物の眼はSEM顕微鏡写真でよく見られる被写体です。カラー写真。
    ナンキョク オキアミ（Euphausia superba）の複眼。SEM像は焦点深度が深いため、節足動物の眼はSEM顕微鏡写真でよく見られる被写体です。カラー写真。
  • 南極オキアミの眼球の個眼。オキアミの眼球を高倍率で撮影したもの。走査型電子顕微鏡（SEM）は、光学顕微鏡から透過型電子顕微鏡（TEM）と同等の倍率まで、幅広い観察範囲をカバーする。カラー画像。
    南極オキアミの眼球の個眼。オキアミの眼球を高倍率で撮影したもの。走査型電子顕微鏡（SEM）は、光学顕微鏡から透過型電子顕微鏡（TEM）と同等の倍率まで、幅広い観察範囲をカバーする。カラー画像。
  • 正常なヒトの循環血液のSEM画像。これは、SEM顕微鏡写真の一般的な被写体である赤血球の、古くノイズの多い顕微鏡写真です。
    正常なヒトの循環血液のSEM画像。これは、SEM顕微鏡写真の一般的な被写体である赤血球の、古くノイズの多い顕微鏡写真です。
  • ミシガン州デボン紀のヘデレロイド（管径最大0.75mm）のSEM画像。SEMは、ミクロおよびマクロの化石の詳細な画像を撮影するために広く使用されています。
    ミシガン州デボン紀のヘデレロイド（管径最大0.75mm）のSEM画像。SEMは、ミクロおよびマクロの化石の詳細な画像を撮影するために広く使用されています。
  • 古代ガラス片中のアンチモンを多く含む領域の反射電子（BSE）像。博物館では、貴重な遺物を非破壊的に研究するためにSEMが使用されています。
    古代ガラス片中のアンチモンを多く含む領域の反射電子（BSE）像。博物館では、貴重な遺物を非破壊的に研究するためにSEMが使用されています。
  • 古代のガラス片の表面の腐食層の SEM 画像。腐食層の層状構造に注目してください。
    古代のガラス片の表面の腐食層の SEM 画像。腐食層の層状構造に注目してください。
  • 半導体製造工程で使用されるフォトレジスト層を電界放出型SEMで撮影したSEM画像。これらのSEMは、その高解像度性能から半導体業界で重要な役割を果たしています。
    半導体製造工程で使用されるフォトレジスト層を電界放出型SEMで撮影したSEM画像。これらのSEMは、その高解像度性能から半導体業界で重要な役割を果たしています。
  • 腎結石表面のSEM像。結石の中心部の非晶質部分からウェッデライト（シュウ酸カルシウム二水和物）の正方晶が出現している様子がわかる。画像の横幅は、図に示した元の結石の0.5 mmに相当する。
    腎結石表面のSEM像。結石の中心部の非晶質部分からウェッデライト（シュウ酸カルシウム二水和物）の正方晶が出現している様子がわかる。画像の横幅は、図に示した元の結石の0.5 mmに相当する。
  • 同じ深さの霜の雪結晶を光学顕微鏡で観察した画像（左）と走査電子顕微鏡（SEM）画像（右）の2枚。光学顕微鏡画像では完全には判別できない微細構造の詳細を、走査電子顕微鏡（SEM）画像では明瞭に捉えることができることに注目してください。
    同じ深さの霜の雪結晶を光学顕微鏡で観察した画像（左）と走査電子顕微鏡（SEM）画像（右）の2枚。光学顕微鏡画像では完全には判別できない微細構造の詳細を、走査電子顕微鏡（SEM）画像では明瞭に捉えることができることに注目してください。
  • タマネギ薄片の内側表面の表皮細胞。シャグリーンのような細胞壁の下には、核と細胞質に浮かぶ小さな細胞小器官が見える。このランタノイド染色サンプルのBSE像は、事前の固定、脱水、スパッタリングを施さずに撮影された。
    タマネギ薄片の内側表面の表皮細胞。シャグリーンのような細胞壁の下には、核と細胞質に浮かぶ小さな細胞小器官が見える。このランタノイド染色サンプルのBSE像は、事前の固定、脱水、スパッタリングを施さずに撮影された。
  • 葉の裏面にある気孔のSEM画像
    葉の裏面にある気孔のSEM画像

参照

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走査型電子顕微鏡に関する図書館資料
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一般的な
  • HowStuffWorks – 走査型電子顕微鏡の仕組み
  • SEMの使い方を学ぶ – SEMを使いたい人のためのオンライン学習環境。Microscopy Australia提供
  • バーチャルSEM – スパークラー – 走査型電子顕微鏡（SEM）のインタラクティブシミュレーション
  • マルチチャンネルカラーSEMイメージング - BSE付き
  • 走査型電子顕微鏡に関するビデオ、カールスルーエ応用科学大学
  • 電子顕微鏡を含む様々な顕微鏡に関するアニメーションと解説（パリ南大学）
歴史
  • 環境走査型電子顕微鏡（ESEM）の歴史
画像
  • Rippel 電子顕微鏡施設、Wayback Machineに 2007 年 3 月 19 日にアーカイブ。ダートマス大学の SEM 画像が多数 (主に生物学的) 掲載されています。
  • モスクワ眼疾患研究所のランタノイド染色SEM画像。