Cas9
CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9
S. pyogenes Cas9とsgRNAおよび標的DNAの複合体。PDB : 4OO8 ​[1 ]
識別子
生物化膿レンサ球菌M1
シンボルcas9
代替記号SpCas9
エントレズ901176
PDB4OO8
RefSeq (mRNA)NC_002737.2
RefSeq（タンパク質）NP_269215.1
ユニプロットQ99ZW2
その他のデータ
EC番号3.1.-.-
染色体ゲノム: 0.85 - 0.86 Mb
検索する
構造スイスモデル
ドメインインタープロ
Cas9
識別子
シンボル?
インタープロIPR028629
利用可能なタンパク質構造:
PDB  IPR028629  
アルファフォールド

Cas9（CRISPR関連タンパク質9、旧称Cas5、Csn1、またはCsx12）は、CRISPRと連携して細胞のゲノムを永続的に改変できるタンパク質です。遺伝子工学の重要なツールです。[ 2 ]エマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナは、CRISPRゲノム編集技術の開発により、 2020年のノーベル化学賞を受賞しました。

Cas9はゲノム編集ツールとして機能し、DNAの部位特異的な二本鎖切断を誘導し、非相同末端結合または相同組換えによる遺伝子の不活性化または挿入を可能にする。[ 3 ]一本鎖切断を引き起こすCas9ニッカーゼ（Cas9n）や異なるPAM配列を認識するバリアントは、CRISPR-Cas9編集の限界に対処している。[ 4 ]

歴史

CRISPR/Casシステムは、細菌がウイルスやバクテリオファージの侵入から身を守る手段として自然界で進化しました。細菌は自身のDNAの一部を宿主ゲノムに挿入することで、その後の感染時に適応免疫系が適切に反応することを可能にしました。このシステムは化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）で発見され、その後多くの種で発見されました。

機構

160キロダルトンのネイティブCas9には、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA）という2つの異なるRNAが結合したガイドRNAが必要です。[ 5 ]

研究

2013年に、MaliらおよびGilbertらは、非切断型Cas9バリアントが特定のDNA配列の転写活性化因子または転写抑制因子を制御できることを報告した。 [ 6 ] [ 7 ]また2013年に、Bikardらは、dCas9がプロモーターまたは伸長中にRNAポリメラーゼを阻害し、遺伝子をサイレンシングすることを報告した。[ 8 ]

2014年、エスベルト、スミドラー、カテルッチア、チャーチは、Cas9をベースとした遺伝子ドライブによって生物集団全体を編集できる可能性を示唆した。[ 9 ]

2017-19

2017年にLiらは、Cas9がB型肝炎ウイルスのゲノム末端を標的とし、感染を減少させることを報告した。[ 10 ]

Jensenらは、クロマチンリモデラーと融合したdCas9がクロマチン構造を変化させることを報告した。[ 11 ] O'Geenらは、FOG1と融合したdCas9がH3K27をメチル化することで遺伝子を抑制することを報告した。[ 12 ]

Lowderらは、dCas9がリプレッサードメインと融合するとAtCSTF64のような植物遺伝子を抑制することを報告した。[ 13 ]

2018年にLeeらは、改変されたCas9が反応速度を変化させることでオフターゲット効果を低減することを報告した。[ 14 ]

2019年にChenとPage-McCawは、Cas9がHIV-1の長い末端反復配列を抑制し、ウイルスゲノムを変異させることを報告した。[ 15 ]

2020

2020年にUddin、Rudin、Senは、Cas9ニッカーゼなどのCas9バリアントがオフターゲット効果を低減することでゲノム編集を改善することを報告した。[ 16 ]

2025年～

2025年に、周、ディアオ、李らは、 CRISPR RNAレベルが低い場合、アポNmeCas9（NmeCas9のRNAフリー型）がタイプII-CシステムでCas1-Cas2を介したCRISPRスペーサー獲得を刺激できることを報告した。[ 17 ]

CRISPRを介した免疫

細菌や古細菌のCRISPRシステムは、ウイルスやプラスミドに対抗するためのプログラム可能な制限酵素として機能する。 [ 18 ] CRISPR遺伝子座は、短い回文反復配列と、外来DNAの配列を格納する可変スペーサー（24～48ヌクレオチド）から構成される。[ 19 ]ユニバーサルcas1、cas2、タイプII特異的cas9などの隣接するcas遺伝子は、免疫タンパク質をコードしている。Cas9はcrRNAとtracrRNAを用いて複合体を形成し、スペーサー配列に一致する外来DNAを標的として切断する。[ 5 ]

適応

CRISPRシステムは、ウイルスの「プロトスペーサー」からのスペーサーをCRISPR遺伝子座に統合し、その認識にはPAM（例：S. pyogenesのNGG）を必要とする。 [ 20 ] Cas9は機能的なスペーサーの獲得を保証する。[ 21 ]しかし、スペーサーは相同組み換えによって失われる可能性がある。[ 22 ] ApoCas9は、II-C型システムでスペーサー獲得を刺激し、獲得活動をCRISPR RNA量と連動させることが報告されており、crRNAが低い（例：アレイ新生または自然なアレイ収縮を起こしている細胞）と獲得が増加し、crRNAが高い（アレイが拡大している）と獲得が減少する。ヌクレアーゼローブのみでも獲得を刺激するのに十分であったが、crRNA依存的な制御には全長Cas9が必要であった。この活性は、いくつかのII-C型Cas9相同遺伝子間で進化的に保存されている。[ 23 ]

CRISPR処理

RNAポリメラーゼはCRISPR遺伝子座をpre-crRNAに転写し、これを特異的なエンドリボヌクレアーゼが1つのスペーサーと部分的な繰り返しを含む小さなcrRNAに切断する。[ 24 ]

干渉

CASCADE複合体内のcrRNAは、相補的な外来DNAと対合する。Cas9は、スペーサーが一致し、PAMが存在する場合、DNAを切断し、ウイルスの複製を停止させる。[ 25 ]

転写制御

エンドヌクレアーゼ活性を欠く不活性Cas9（dCas9）は、DNAに結合して転写を制御する。[ 26 ] 真核生物では、dCas9はエンハンサー配列を標的として転写因子の組み立てを防ぐ。[ 27 ] Gilbert、Horlbeck、Adamson、Villalta、Chen、Whitehead、Guimaraes、Panning、Ploegh、Bassik、Qi、Kampmann、およびWeissmanは、遺伝子抑制のためのゲノムワイドdCas9スクリーニングを実施した。[ 28 ] O'Connell、Oakes、Sternberg、East-Seletsky、Kaplan、およびDoudnaは、PAM相補鎖を含むssDNAとハイブリダイズするとCas9がmRNAを切断することを報告した。[ 29 ] CRISPRaのように転写活性化因子と融合したdCas9は、Gilbertらの報告によると遺伝子を活性化する。[ 30 ]

構造研究

Cas9は、αヘリカルローブ（REC）とヌクレアーゼローブ（NUC）からなる二葉構造を特徴とし、HNHドメインとRuvCドメインがブリッジヘリックスで連結されている。[ 31 ] HNHドメインは標的DNA鎖を切断し、RuvCは非標的鎖を切断する。[ 32 ] PAM相互作用ドメイン（PI、オレンジ色）はNGG PAM配列を認識する。sgRNAはcrRNA-tracrRNA複合体を置換し、標的DNAとT字型構造を形成する。[ 33 ] 2014年の研究では、REC1ドメインとブリッジヘリックスドメインがsgRNAの認識に重要であることが報告されている。[ 34 ]

DNA切断

Cas9のHNHドメインとRuvCドメインはそれぞれ標的DNA鎖と非標的DNA鎖を切断し、PAM配列（S. pyogenesの場合はNGG ）を必要とする。[ 33 ] 2020年の研究では、NAGおよびNGA PAMは効率が低いことが報告されている。[ 35 ] 2016年の研究では、切断によって1ヌクレオチドの5'オーバーハングが生成され、テンプレート挿入が有利になることが多いと報告されている。[ 36 ] 2024年の研究では、標的切断の85％が平滑であり、15％が1ヌクレオチドのオーバーハングを持つことが報告されている。[ 37 ] 2018年の研究では、切断効率はgRNA-DNA二重鎖の自由エネルギー変化に依存すると報告されている。[ 38 ] 2016年の別の研究では、安定したgRNAフォールディングが切断を損なう可能性があることが報告されている。[ 39 ]

細菌の編集における課題

1995年の研究では、細菌の制限修飾システムがCas9導入遺伝子を含む外来DNAを切断し、ゲノム編集を妨げることが報告されている。[ 40 ]

アプリケーション

遺伝子編集

Cas9は、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）[ 41 ] 、カンジダ・アルビカンス[ 42 ] 、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ） [ 43 ]、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）[ 44 ] 、アリ（ハルペグナトス・サルタトールおよびオオセラエア・ビロイ） [ 45 ]、[ 46 ] 、蚊（ネッタイシマカ） [ 47 ] 、線虫（カエノラブディティス・エレガンス）[ 48 ]、植物[49]、マウス（ムス・ムスクルス・ドメスティカス）[50]、サル[ 51 ]など、様々な種のゲノムを編集します。

細胞防御

CRISPR/Cas9は、バクテリオファージ、プラスミド、DNAウイルスなどの侵入者に対する細菌の防御に役立ちます。Cas9はRNA誘導によりエンドヌクレアーゼ酵素として働き、外来DNAを標的として切断します。[ 5 ] [ 33 ] Cas9は外来DNAをほどき、対応する部位を切断します。これは真核生物のRNA干渉機構に似ています。

遺伝子制御

Cas9の他のバージョンはDNAに結合することはできるが、切断はできない。これらは転写活性化遺伝子や転写抑制遺伝子を制御し、遺伝子の活性化と抑制を管理するために使用できる。[ 52 ] [ 53 ]

より技術的には、Cas9は、Streptococcus pyogenesのCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ）適応免疫システムに関連するRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼ酵素です。[ 5 ] [ 33 ] [ 54 ] S. pyogenesはCRISPRを利用して記憶し、その後Cas9を使用して侵入したバクテリオファージDNAやプラスミドDNAなどの外来DNAを調べて切断します。[ 33 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] Cas9は、外来DNAをほどき、ガイドRNA （gRNA）の20ヌクレオチドのスペーサー領域に相補的な部位をチェックすることでこの調査を実行します。DNA基質がガイドRNAに相補的であれば、Cas9は侵入したDNAを切断します。この意味で、CRISPR-Cas9のメカニズムは真核生物のRNA干渉（RNAi）のメカニズムと類似している。細菌免疫における本来の機能とは別に、Cas9はDNAの部位特異的二本鎖切断を誘発するゲノム工学ツールとして利用されてきた。これらの切断は、モデル生物において、非相同末端結合または相同組換えを介した遺伝子不活性化または異種遺伝子の導入につながる可能性がある。cas9バリアントの研究は、 CRISPR-Cas9ゲノム編集の限界を克服する有望な方法となっている。例としては、一本鎖切断（SSB）を誘発するバリアントであるCas9ニッカーゼ（Cas9n）や、異なるPAM配列を認識するバリアントが挙げられる。[ 58 ]ジンクフィンガーヌクレアーゼや転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）タンパク質とともに、Cas9はゲノム編集の分野で重要なツールになりつつある。

Cas9は、ガイドRNAと相補的な配列をほぼすべて切断できるため、近年注目を集めています。[ 33 ] Cas9の標的特異性は、ガイドRNAとDNAの相補性に由来するものであり、タンパク質自体の改変（TALENやジンクフィンガーなど）によるものではないため、新しいDNAを標的とするようにCas9を改変することは容易です。[ 59 ] Cas9の標的化は、キメラシングルガイドRNA（chiRNA）の改変によって簡素化されました。科学者たちは、Cas9ベースの遺伝子ドライブによって、生物集団全体のゲノムを編集できる可能性があると示唆しています。[ 60 ] 2015年には、Cas9を用いて初めてヒト胚のゲノムが改変されました。[ 61 ]

歴史

Cas9エンドヌクレアーゼは、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）という2つの小分子を含む4つの要素からなるシステムです。[ 5 ] [ 62 ] 2012年に、ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエは、2つのRNA分子を「シングルガイドRNA 」に融合することで、Cas9エンドヌクレアーゼをより扱いやすい2要素システムに再設計しました。これは、Cas9と組み合わせることで、ガイドRNAによって指定されたDNAターゲットを見つけて切断できるようになりました。[ 63 ]この貢献は非常に大きく、 2020年にノーベル化学賞によって認められました。ガイドRNAのヌクレオチド配列を操作することで、人工Cas9システムは、分離のために任意のDNA配列をターゲットにするようにプログラムできます。[ 63 ] Virginijus Šikšnys、Gasiūnas、Barrangou、Horvathによる別の共同研究は、 S. thermophilus CRISPRシステムのCas9も、crRNAの配列を変更することで任意の部位を標的とするように再プログラムできることを示しました。これらの進歩は、改変CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集の取り組みを加速させました。[ 64 ]

Feng Zhang氏とGeorge Church氏が率いるグループは、CRISPR-Cas9を使用したヒト細胞培養におけるゲノム編集に関する記述を初めて同時に発表した。[ 65 ] [ 66 ] [ 67 ]それ以来、パン酵母（サッカロミセス・セレビシエ）、[ 68 ] [ 69 ] [ 70 ]日和見病原体カンジダ・アルビカンス、[ 71 ] [ 72 ]ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ）、[ 73 ]ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）、[ 74 ] [ 75 ]アリ（ハルペグナトス・サルタトール[ 76 ]およびオオセラエア・ビロイ[ 77 ]）、蚊（ネッタイシマカ[ 78 ]）、線虫（線虫）、[ 79 ]植物、[ 80 ]マウス（ムス・ムスクルス・ドメスティカス）、[ 81 ] [ 82 ]サル[ 83 ]およびヒトの胎児[ 84 ]

CRISPRは、標的遺伝子の活性化またはサイレンシングを可能にするプログラム可能な転写因子を作成するために改変されている。[ 85 ]

CRISPRヌクレアーゼCas12aとCas9の図。PAM配列に対するDNA切断の位置を拡大して表示しています。

CRISPR-Cas9システムは、ヒト三核接合体において効果的な遺伝子編集を行うことが示されており、これは2015年に中国の科学者P. Liang氏とY. Xu氏によって発表された論文で初めて報告されている。このシステムは、54個の胚のうち28個において変異βヘモグロビン（HBB）の切断に成功した。28個のうち4個の胚は、ドナーテンプレートを用いた組換えに成功した。科学者らは、切断されたDNA鎖の組換えにおいて、相同な内因性配列HBDが外因性ドナーテンプレートと競合することを示した。ヒト胚におけるDNA修復は、由来幹細胞よりもはるかに複雑で特殊である。[ 86 ]

CRISPRを介した免疫

バクテリオファージで満たされた、さまざまな過酷で住みにくい生息地で生き残るために、細菌や古細菌は捕食性ウイルスを回避し、撃退する方法を発達させてきました。これには、適応免疫の CRISPR システムが含まれます。実際には、CRISPR/Cas システムは自己プログラム可能な制限酵素として機能します。CRISPR 遺伝子座は、規則的な間隔で発生する短い回文反復配列で構成され、交互の CRISPR リピートと、24～48 ヌクレオチド長の可変 CRISPR スペーサーで構成されます。これらの CRISPR 遺伝子座には通常、隣接する CRISPR 関連 (cas) 遺伝子が伴います。2005 年、3 つの別々のグループによって、スペーサー領域が、プラスミドやウイルスなどの外来 DNA 要素と相同であることが発見されました。これらの報告は、CRISPR が免疫システムとして機能する可能性があるという最初の生物学的証拠を提供しました。

Cas9はゲノム編集ツールとしてよく使われています。Cas9は、ウイルスが宿主のDNAを操作するのを防ぐ最近の開発にも使われています。CRISPR-Cas9は細菌のゲノムシステムから開発されたため、ウイルスの遺伝物質を標的とするために使用できます。Cas9酵素の使用は、多くのウイルス感染症の解決策となり得ます。Cas9は、ウイルスの遺伝情報の特定の鎖を標的とすることで、特定のウイルスを標的とする能力を持っています。より具体的には、Cas9酵素は、ウイルスが正常な機能を実行するのを妨げるウイルスゲノムの特定のセクションを標的とします。[ 87 ] Cas9はまた、疾患や変異したDNA鎖を引き起こす有害なDNAおよびRNA鎖を破壊するためにも使われてきました。Cas9はすでに、HIV-1の影響を破壊することに期待が持てることを示しており、Cas9はHIV-1の長い末端反復配列の発現を抑制することが示されています。 Cas9はHIV-1ゲノムに導入されると、HIV-1の鎖を変異させる能力があることが示されています。[ 88 ] [ 89 ] Cas9は、B型肝炎ウイルスゲノム内の特定の長い末端反復配列の末端を標的とすることで、B型肝炎の治療にも使用されています。 [ 90 ] Cas9は、マウスの白内障を引き起こす変異を修復するために使用されています。

図2：CRISPR免疫の段階

CRISPR-Casシステムは、遺伝子の内容と構造の違いに基づいて、3つの主要なタイプ（タイプI、タイプII、タイプIII）と12のサブタイプに分類されます。しかし、すべてのCRISPR-Casシステムの基本となる特徴は、cas遺伝子とそのタンパク質です。cas1とcas2はタイプとサブタイプを問わず普遍的ですが、cas3、cas9、cas10はそれぞれタイプI、タイプII、タイプIIIのシグネチャー遺伝子です。

CRISPR-Cas防御段階

適応

適応には、CRISPR遺伝子座位における隣接する2つの反復配列間のスペーサーの認識と組み込みが関与する。「プロトスペーサー」とは、ウイルスゲノム上でスペーサーに対応する配列を指す。プロトスペーサーの近傍には、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い保存されたヌクレオチド配列が存在する。PAMはDNA断片の取得に用いられる認識モチーフである。[ 57 ]タイプIIでは、Cas9は適応中にPAMを認識し、機能的なスペーサーの取得を確実にする。[ 55 ]

スペーサーの喪失や複数のスペーサーのグループの喪失も、Aranaz et al. 2004とPourcel et al. 2007によって観察されている。これはおそらく、反復配列間の物質の相同組換えによって起こると考えられる。[ 91 ]

CRISPR処理/生合成

CRISPRの発現には、CRISPR RNA（pre-crRNA）と呼ばれる一次転写産物の転写が含まれます。これはRNAポリメラーゼによってCRISPR遺伝子座から転写されます。その後、特定のエンドリボヌクレアーゼがpre-crRNAを切断して小さなCRISPR RNA（crRNA）を生成します。[ 92 ]

干渉/耐性

干渉は、CASCADEと呼ばれる多タンパク質複合体内のcrRNAに関与し、挿入される相補的な外来DNA領域を認識し、特異的に塩基対形成する。crRNA-外来核酸複合体は切断されるが、スペーサーと標的DNAの間に不一致がある場合、またはPAMに変異がある場合、切断は開始されない。後者の場合、外来DNAは細胞による攻撃の標的とならず、ウイルスの複製が進行し、宿主はウイルス感染に対して免疫を持たない。干渉段階は、CRISPRの獲得および発現とはメカニズム的にも時間的にも異なる可能性があるが、防御システムとして完全に機能するためには、3つの段階すべてが機能する必要がある。[ 93 ]

ステージ1：CRISPRスペーサーの組み込み。プロトスペーサーとプロトスペーサー関連モチーフ（赤で表示）は、宿主DNA中のCRISPRアレイの「リーダー」末端に獲得される。CRISPRアレイは、リピート配列（黒の菱形）に挟まれたスペーサー配列（色付きのボックスで表示）で構成される。このプロセスにはCas1とCas2（およびタイプIIではCas9 [ 55 ]）が必要であり、これらは通常CRISPRアレイの近傍に位置するcas遺伝子座にコードされている。

ステージ2：CRISPR発現。pre-crRNAは、宿主RNAポリメラーゼによってリーダー領域から転写され、その後Casタンパク質によって、単一のスペーサーと部分的なリピート（色付きのスペーサーを持つヘアピン構造として示される）を含む小さなcrRNAに切断されます。

ステージ3：CRISPR干渉。外来DNAと強い相補性を持つスペーサーを持つcrRNAは切断イベント（ハサミで図示）を開始し、Casタンパク質を必要とします。DNA切断はウイルスの複製を阻害し、宿主に免疫を与えます。干渉段階は、CRISPRの獲得および発現（細胞を分割する白い線で図示）とは機能的かつ一時的に区別される場合があります。

dCas9を用いた転写不活性化

dCas9はエンドヌクレアーゼ欠損型Cas9とも呼ばれ、遺伝子の目的の部位の転写結合部位に適用することで遺伝子発現の編集に利用できる。dCas9の最適な機能はその作用様式に起因している。ヌクレオチドがRNA鎖に追加されなくなり、その結果その鎖の伸長が停止すると遺伝子発現が阻害され、結果として転写プロセスに影響を及ぼします。このプロセスはdCas9が大量生産される際に発生し、配列特異的ガイドRNA分子を介して、任意の時点でほとんどの遺伝子に影響を及ぼすことができる。dCas9は遺伝子発現を下方制御するようであるため、抑制性クロマチン修飾ドメインと組み合わせて使用​​するとこの作用はさらに増幅される。[ 94 ] dCas9タンパク質には、遺伝子発現の制御以外にも機能がある。 dCas9タンパク質にプロモーターを付加することで、両者は互いに作用し合い、DNA鎖上の異なる配列における転写の開始または停止を効率的に行うことができます。これら2つのタンパク質は、遺伝子の特定の部位に作用します。これは、特定の種類の原核生物においてよく見られる現象で、プロモーターとdCas9が互いに配列することで、ヌクレオチドポリマーが伸長して転写されたDNA断片を形成する能力を阻害します。プロモーターがない場合、dCas9タンパク質は単独でも、遺伝子本体と組み合わせても、同様の効果を発揮しません。[ 95 ]

転写抑制の効果をさらに詳しく調べると、ヒストンのアミノ酸成分であるH3K27は、dCas9とFOG1と呼ばれるペプチドとの相互作用によってメチル化される。本質的に、この相互作用は遺伝子の特定の接合部におけるアミノ酸複合体のC+N末端領域で遺伝子抑制を引き起こし、結果として転写を終結させる。[ 96 ]

dCas9は、疾患を引き起こす可能性のある特定のタンパク質を改変する際にも有効であることが証明されています。dCas9がガイドRNAと呼ばれるRNAに結合すると、生物のゲノムに悪影響を及ぼす可能性のある繰り返しコドンやDNA配列の増殖を抑制します。つまり、複数の繰り返しコドンが生成されると、dCas9は反応を誘発するか、それらのコドンの過剰産生に対抗するためにdCas9を大量にリクルートし、転写を停止させます。dCas9はgRNAと相乗的に作用し、DNAポリメラーゼIIに直接作用して転写の継続を阻害します。

dCas9タンパク質の作用機序に関する更なる説明は、植物における遺伝子産生を制御し、特定の形質を増強または減少させることによって植物ゲノムを利用するという点に見出すことができる。CRISPR-CAS9システムは、遺伝子をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションする能力を有する。dCas9タンパク質はCRISPR-CAS9システムの構成要素であり、植物遺伝子の特定の領域を抑制することができる。これはdCAS9がリプレッサードメインに結合することで起こり、植物の場合、AtCSTF64などの制御遺伝子の不活性化が実際に起こる。[ 97 ]

細菌もまた、dCas9タンパク質の利用対象です。真核生物はDNA構造とゲノムが大きく、細菌ははるかに小さいため操作が容易です。そのため、真核生物はdCas9を用いてRNAポリメラーゼによる遺伝物質の転写プロセスを阻害します。[ 98 ]

構造および生化学的研究

結晶構造

Cas9の構造
Nishimasuらによる PDB 5AXW に基づく CRISPR 関連タンパク質 Cas9 の結晶構造。

Cas9は二葉構造を特徴とし、ガイドRNAはαヘリカルローブ（青）とヌクレアーゼローブ（シアン、オレンジ、グレー）の間に挟まれています。これら2つのローブは、1本のブリッジヘリックスによって連結されています。マルチドメインヌクレアーゼローブには、非標的DNA鎖を切断するRuvC（グレー）と、標的DNA鎖を切断するHNHヌクレアーゼドメイン（シアン）という2つのヌクレアーゼドメインが存在します。RuvCドメインは、三次構造において相互作用する複数の異なる部位によってコードされており、RuvC切断ドメインを形成します（右図参照）。

Cas9のApo型の結晶構造。[ 99 ]構造のレンダリングはUCSF Chimeraソフトウェアを使用して行われた。

標的DNAの重要な特徴は、3ヌクレオチド配列NGGからなるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含んでいることです。このPAMは、Cas9のC末端付近に位置するPAM相互作用ドメイン（PIドメイン、オレンジ色）によって認識されます。Cas9は、アポ（アポ酵素）、ガイドRNA結合状態、ガイドRNA：DNA結合状態の間で明確な構造変化を起こします。

Cas9 はCRISPR 遺伝子座に固有のステムループ構造を認識し、crRNA-tracrRNAリボ核タンパク質複合体の成熟を媒介します。[ 100 ] CRISPR RNA (crRNA) およびトランス活性化 crRNA (tracrRNA) と複合した Cas9 は、標的の dsDNA をさらに認識して分解します。[ 101 ]ここに示す共結晶構造では、crRNA-tracrRNA 複合体が、天然の RNA 複合体と同じ機能を持つことが証明されているキメラのシングルガイド RNA (sgRNA、赤) に置き換えられています。 [ 33 ]標的 ssDNA と対になった sgRNA 塩基は、T 字型構造として Cas9 によって固定されます。DNA に結合した Cas9 酵素のこの結晶構造は、ヌクレアーゼ ローブに対するアルファヘリックス ローブの明確な構造変化、および HNH ドメインの位置を明らかにしています。このタンパク質は認識ローブ（REC）とヌクレアーゼローブ（NUC）から構成されています。HNHを除くすべての領域は、互いに、そしてsgRNA-ssDNA複合体と密接な相互作用を形成しますが、HNHドメインはタンパク質の他の部分とほとんど接触しません。結晶中で観察されたCas9複合体の別のコンフォメーションでは、HNHドメインは観察されません。これらの構造は、HNHドメインのコンフォメーションの柔軟性を示唆しています。

現在までに少なくとも3つの結晶構造が研究され、発表されている。1つはアポ状態のCas9の立体構造を表し、[ 99 ]、もう2つはDNA結合状態のCas9を表している。[ 102 ] [ 1 ]

sgRNAとの相互作用

クリスパー/キャス9

sgRNA-Cas9複合体では、結晶構造に基づくと、REC1、BH、およびPIドメインが、リピート領域とスペーサー領域の両方でバックボーンまたは塩基と重要な接触を持っている。[ 1 ] [ 102 ] REC1またはREC2ドメインの欠失やBHの残基変異を含むいくつかのCas9変異体がテストされている。REC1およびBH関連変異体は、野生型と比較して低い活性または全く活性を示さず、これはこれら2つのドメインがリピート配列でのsgRNA認識と複合体全体の安定化に重要であることを示している。スペーサー配列とCas9、およびPIドメインとリピート領域の相互作用についてはさらなる研究が必要であるが、共結晶はCas9とsgRNAの間に明確なインターフェースを示している。

DNA切断

Cas9ヌクレアーゼとそのDNA切断位置

これまでの配列解析と生化学研究では、Cas9にはMcrA様HNHヌクレアーゼドメインとRuvC様ヌクレアーゼドメインの2つのヌクレアーゼドメインが含まれていると仮定されています。[ 103 ]これらのHNHおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインは、それぞれ相補的/標的DNA鎖と非相補的/非標的DNA鎖の切断を担っています。[ 33 ]配列類似性は低いものの、RNase Hに類似した配列にはRuvCフォールド（RNase Hファミリーの1つのメンバー）があり、HNH領域はT4 Endo VII（HNHエンドヌクレアーゼファミリーの1つのメンバー）としてフォールドされています。

野生型のS. pyogenes Cas9 は、RNA を介した DNA 切断にマグネシウム (Mg 2+ )補因子を必要とするが、 Cas9 は他の二価金属イオンの存在下ではさまざまなレベルの活性を示すことが示されている。[ 33 ]たとえば、マンガン (Mn 2+ ) 存在下での Cas9 は、RNA 非依存的に DNA 切断できることが示されている。[ 104 ] Cas9 による DNA 切断の速度論は、このデータが反応の複雑さに関する洞察を提供するため、科学界で大きな関心を集めている。 RNA に結合した Cas9 による DNA の切断は比較的迅速 ( k ≥ 700 s −1 ) であることが示されているが、切断産物の放出は非常に遅い ( t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43–91 h ) ため、基本的に Cas9 は単一ターンオーバー酵素となっている。[ 105 ] Cas9の動態に関する追加の研究では、改変されたCas9は反応速度を変更することでオフターゲット効果を低減するのに効果的であることが示されています。 [ 106 ] [ 107 ]

Cas9の切断効率は多くの要因に依存します。重要な要件は、切断部位から下流の非標的鎖3ヌクレオチドに有効なPAMが存在することです。[ 33 ] S. Pyogenes Cas9の標準的なPAM配列はNGGですが、切断活性は低くなりますが、代替モチーフも許容されます。野生型S. Pyogenes Cas9の最も効率的な代替PAMモチーフはNAGとNGAです。[ 108 ] [ 109 ] gRNAの20ヌクレオチドスペーサー領域に相補的な標的DNA部位の配列構成も、切断効率に影響します。効率に影響を与える最も重要なヌクレオチド構成特性は、PAM近位領域のものです。[ 110 ] [ 111 ] [ 109 ]核酸の自由エネルギー変化も、切断活性の定義に大きく関連しています。[ 112 ] 効率に加えて、標的配列中のPAMに最も近い5つのヌクレオチドのヌクレオチド組成も切断プロファイルに影響を及ぼし、DNA切断が鈍的になるか、または交互になるかに影響を及ぼします。[ 113 ] DNAに結合して二重鎖を形成するガイドRNAは、結合自由エネルギー変化の制限された範囲内に収まり、極端に弱い結合や安定した結合を排除するため、通常は効率的に機能します。[ 109 ]安定したガイドRNAの折り畳み構造も切断を損なう可能性があります。[ 114 ]

DNA切断パターン

Cas9ヌクレアーゼは、HNHとRuvCという2つのヌクレアーゼドメインを有し、それぞれ標的鎖（TS）と非標的鎖（NTS）を切断する役割を担っています。このヌクレアーゼの画期的な構造解析により、HNHドメインはプロトスペーサーの18番目と17番目の塩基の間（18|17）を正確に切断する一方、RuvCは同じ塩基の間と下流の塩基を切断することが示されました。[ 33 ]

分子動力学シミュレーションを用いた研究では、標的配列の17|16間のNTS切断が18|17間の切断よりもエネルギー的に有利であり、1ヌクレオチドの5' ssDNAオーバーハングが生成されることが報告されている[ 115 ] 。特に、著者らは5'オーバーハングが埋められ、DNA修復産物はテンプレート挿入であり、5'オーバーハングはPol4によって修復反応のテンプレートとして使用されることを実証した。このずれた切断と正確なテンプレート挿入との関連性は、ヒト細胞を用いた追加研究によって裏付けられている[ 116 ] 。 [ 117 ]

最近、Cas9切断プロファイルのハイスループット調査により、オンターゲット切断の約85%が平滑切断であり、約15%が1ヌクレオチドの5'オーバーハングを有することが明らかになりました。[ 113 ]オフターゲットではオンターゲット部位と比較して、スタッガード切断率が高く、オフターゲットの約3分の1が1～3ヌクレオチドの5'オーバーハングを示しました。切断プロファイル解析により、ターゲット配列の配列パターンは平滑切断またはスタッガード切断の形成に有利であり、スタッガード切断は予測可能なインデルの形成に有利であることが明らかになりました。

細菌がCas9編集にもたらす問題

ほとんどの古細菌や細菌は、Cas9によるゲノム編集を頑固に拒否します。これは、それらに影響を与えない外来DNAをゲノムに付加できるためです。これらの細胞がCas9に抵抗するもう一つの方法は、制限修飾（RM）システムです。バクテリオファージが細菌や古細菌の細胞に侵入すると、RMシステムの標的となります。RMシステムはバクテリオファージのDNAを制限酵素で断片に切断し、エンドヌクレアーゼを用いてDNA鎖をさらに破壊します。これはCas9編集にとって問題となります。なぜなら、RMシステムはCas9プロセスによって追加された外来遺伝子も標的としてしまうからです。[ 118 ]

Cas9の転写調整への応用

dCas9による転写の干渉

Cas9はゲノム中のあらゆる相補配列に結合できるという独自の能力を持つことから、研究者たちはこの酵素を用いて様々なゲノム遺伝子座の転写を抑制したいと考えていました。これを実現するために、RuvCドメインとHNHドメインの2つの重要な触媒残基をアラニンに変異させることで、Cas9のエンドヌクレアーゼ活性をすべて失わせることができました。こうして得られたタンパク質は「dead」Cas9、略して「dCas9」と呼ばれ、依然としてdsDNAにしっかりと結合することができます。この触媒不活性型Cas9バリアントは、Cas9のDNA結合メカニズム研究と、汎用的なプログラム可能なDNA結合RNA-タンパク質複合体として利用されてきました。

dCas9と標的dsDNAの相互作用は非常に緊密であるため、高モル濃度の尿素タンパク質変性剤でもdCas9 RNA-タンパク質複合体をdsDNA標的から完全に解離することはできない。[ 119 ] dCas9は、改変されたシングルガイドRNAを用いて、あらゆる遺伝子座の転写開始部位を標的とし、プロモーターにおいてRNAポリメラーゼと競合して転写を停止することができる。[ 120 ]また、dCas9は遺伝子座のコード領域を標的とすることができるため、転写の伸長段階でRNAポリメラーゼの阻害が起こる。[ 120 ]真核生物では、dCas9をエンハンサー配列に標的とすることで遺伝子発現のサイレンシングを拡大することができ、dCas9は転写因子の組み立てを阻害して特定の遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。[ 53 ]さらに、dCas9に提供されるガイドRNAは、その相補的な同族配列に対する特定のミスマッチを含むように設計することができ、これにより、dCas9とプログラムされた同族配列の相互作用が定量的に弱まり、研究者が目的の遺伝子に適用される遺伝子サイレンシングの程度を調整することができる。[ 120 ]この技術は、遺伝子発現がRNAレベルで調節されるという点で、 RNAi と原理的に似ている。しかし、dCas9アプローチは、RNAiスクリーンと比較して、オフターゲット効果が少なく、一般にdCas9の使用によるサイレンシング効果が大きく再現性が高いため、大きな注目を集めている。[ 121 ]さらに、遺伝子サイレンシングに対するdCas9アプローチは定量的に制御できるため、研究者は目的の遺伝子が抑制される程度を正確に制御できるようになり、遺伝子調節と遺伝子化学量論に関するより多くの疑問に答えることができる。

dCas9は、転写感受性部位に直接結合するだけでなく、様々な調節タンパク質ドメインと融合することで、無数の機能を発揮することができます。最近では、dCas9はクロマチンリモデリングタンパク質（HDAC/HAT）と融合され、様々な遺伝子座周辺のクロマチン構造を再構成しています。[ 120 ]ヘテロクロマチン構造はCas9の結合を阻害するため、これは様々な真核生物遺伝子を標的とする上で重要です。さらに、Cas9はヘテロクロマチンに反応できるため、この酵素を様々な遺伝子座のクロマチン構造の研究に応用できると理論づけられています。[ 120 ]さらに、dCas9は遺伝子抑制のゲノムワイドスクリーニングにも利用されています。数千の遺伝子を標的とすることができる大規模なガイドRNAライブラリを用いることで、dCas9を用いたゲノムワイド遺伝子スクリーニングが実施されています。[ 122 ]

Cas9を用いて転写をサイレンシングするもう一つの方法は、触媒活性を持つCas9酵素を用いてmRNA産物を直接切断することです。[ 123 ]このアプローチは、ssRNAのPAM相補配列を持つssDNAをハイブリダイズさせることで可能となり、Cas9結合のためのdsDNA-RNA PAM部位が確保されます。この技術により、RNAへの化学修飾やRNAタグ付け法を必要とせずに、細胞内の内因性RNA転写産物を単離することが可能になります。

dCas9融合タンパク質による転写活性化

遺伝子サイレンシングとは対照的に、dCas9は転写活性化因子と融合することで遺伝子を活性化するためにも用いられる。[ 120 ]これらの因子には、細菌RNAポリメラーゼIIのサブユニットや真核生物の従来の転写因子が含まれる。最近では、「CRISPRa」と呼ばれるdCas9融合タンパク質を用いて転写活性化のゲノムワイドスクリーニングも達成されている。[ 122 ]

参照

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さらに読む

  • PDBe-KBのUniProt : Q99ZW2 (Streptococcus pyogenes CRISPR 関連エンドヌクレアーゼ Cas9/Csn1)のPDBで入手可能なすべての構造情報の概要。
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