伸長ポリ(A)試験

拡張ポリ(A)テスト（ePAT）は、 mRNA分子のポリ(A)テールの長さを決定する方法を説明するものです。このテストは、2012年にA. Jänickeらによって開発され、解説されました。

この方法は 3 つの独立したステップから構成されます。第 1 ステップでは、ポリアデニル化 RNA を、5' 末端にポリデオキシチミジン配列を持つ DNAオリゴヌクレオチドにハイブリダイズします。次に、クレノウポリメラーゼが DNA オリゴヌクレオチドをテンプレートとして使い、mRNA の 3' 末端の伸長を触媒します。この反応は 25 °C で起こります。第 2 ステップでは、逆転写酵素合成により、mRNA の伸長した 3' 末端にアニールした DNA オリゴヌクレオチドが伸長します。内部のポリ (A) 配列にハイブリダイズした DNA オリゴマーが逆転写のプライマーとして機能しないようにするため、第 2 ステップは 55 °C で実行されます。第 3 段階および最終段階では、新しく合成されたcDNAをPCRで増幅します。この PCR には、遺伝子特異的プライマーとユニバーサルプライマーが 1 つずつ必要です。アンプリコンの長さを分析することで、2 つのプライマーに挟まれた配列、つまりサンプル mRNA のポリ (A) テールの長さを推定できます。

著者らによると、ポリ(A)テールの長さと異なる転写産物間の分布を測定するこの方法は、より面倒なタンパク質翻訳状態の分析の代わりに、細胞の翻訳状態を決定するために使用できるとのことだ。^{[ 1 ]}

参考文献

1. Jänicke A, Vancuylenberg J, Boag PR, Traven A, Beilharz TH (2012年6月). 「ePAT：アデニル化RNAをタグ付けしてポリ(A)末端長を測定する簡便法とその他の3' RACEアプリケーション」 . RNA . 18 ( 6): 1289–95 . doi : 10.1261/rna.031898.111 . PMC  3358650. PMID  22543866 .