高速並列タンパク質分解
FASTpp（高速並列プロテオリシス）。タンパク質混合物を複数のチューブに分注し、異なる温度と耐熱性プロテアーゼに同時に曝露する。残ったタンパク質はSDS-PAGEで分離できる。

高速並列タンパク質分解（FASTpp ）は、タンパク質のどの部分が急速なタンパク質分解に抵抗するかを測定することによって、タンパク質の熱安定性を決定する方法である。 [ 1 ]

歴史と背景

タンパク質分解は、生化学および細胞生物学においてタンパク質構造を調べるために広く用いられている。[ 2 ] [ 3 ]「限定トリプシンタンパク質分解」では、少量のプロテアーゼが折り畳まれたタンパク質と折り畳まれていないタンパク質の両方を分解するが、その速度は大きく異なる。つまり、構造化されていないタンパク質はより速く切断されるのに対し、構造化されたタンパク質はより遅い速度で切断される（場合によっては桁違いに遅い）。近年、折り畳まれていないタンパク質を切断する特異性が高い他のプロテアーゼを利用した、タンパク質分解に基づくタンパク質安定性のアッセイがいくつか提案されている。これらには、パルスタンパク質分解法、[ 4 ]、タンパク質分解走査熱量測定法[ 5 ]、FASTppなどがある。

仕組み

FASTppは、様々な条件下で消化に抵抗するタンパク質の量を測定します。この目的のために、露出した疎水性残基を特異的に切断する耐熱性プロテアーゼが使用されます。FASTppアッセイは、熱変性、耐熱性プロテアーゼの変性画分に対する特異性、およびSDS-PAGEの分離能を組み合わせています。[ 6 ]この組み合わせにより、FASTppは、最大85℃の温度、 pH 6～9、プロテオーム全体の有無など、広い物理化学的条件下で、折り畳まれた画分の変化を検出できます。用途は、バイオテクノロジーから点突然変異の研究、リガンド結合アッセイまで多岐にわたります。

アプリケーション

FASTppは以下の調査に使用されています: [ 1 ]

  • タンパク質の安定性に対する溶解物の影響
  • 熱プロテオーム安定性[ 7 ]
  • 折り畳みと綴じの結合[ 8 ]
  • 折り畳み率と安定性に対するリガンド効果[ 9 ]
  • 変異が折り畳み率と安定性に与える影響（例：点変異/ミスセンス変異[ 9 ] [ 10 ]）
  • タンパク質の運動学的安定性[ 11 ]

テクノロジー

まず、ガラスビーズ破砕、加圧ホモジナイゼーション、あるいは目的タンパク質を変性させない化学的または物理的な溶解法によって細胞溶解液を生成します。（標的分析の場合はオプション）この溶解液から、本質的に不規則なタグに基づくアフィニティー法[ 12 ]やその他の適切な精製戦略によって目的タンパク質が精製されます。これらの精製戦略には、多くの場合、複数の直交クロマトグラフィーステップが含まれます。

この（全タンパク質または精製タンパク質）溶液をPCRストリップの複数のチューブに分注する。すべての分注液は、熱勾配PCRサイクラーで、耐熱性プロテアーゼであるサーモリシンの存在下で、異なる最高温度に同時にさらされる（図参照）。自動温度制御は、PCRで一般的に使用されるサーモリシンサイクラーで実現される。反応産物はSDS-PAGEまたはウェスタンブロットで分離することができる。[ 6 ]プロテアーゼであるサーモリシンはEDTA で完全に不活性化することができる。サーモリシンのこの特性により、FASTppは、例えば質量分析のための後続のトリプシン消化と互換性がある。[ 13 ] [ 14 ] [ 7 ]

参考文献

  1. ^ a b Minde, DP; Maurice, MM; Rüdiger, SGD (2012). Uversky, Vladimir N (編). 「高速タンパク質分解アッセイFASTppによる溶解物中の生物物理学的タンパク質安定性の測定」 . PLOS ONE . 7 (10) e46147. Bibcode : 2012PLoSO...746147M . doi : 10.1371 /journal.pone.0046147 . PMC  3463568. PMID  23056252 .
  2. ^ Johnson, DE; Xue, B.; Sickmeier, MD; Meng, J.; Cortese, MS; Oldfield, CJ; Le Gall, T.; Dunker, AK; Uversky, VN (2012). 「タンパク質構造イニシアチブによるタンパク質の固有不規則性のハイスループット特性評価」 . Journal of Structural Biology . 180 (1): 201– 215. doi : 10.1016 / j.jsb.2012.05.013 . PMC 3578346. PMID 22651963 .  
  3. ^ Hoelen, H.; Kleizen, B.; Schmidt, A.; Richardson, J.; Charitou, P.; Thomas, PJ; Braakman, I. (2010). Uversky, Vladimir N. (編). 「変異ドメインの翻訳中に現れるΔF508 CFTRの主要なフォールディング欠陥と救済」 . PLOS ONE . 5 (11) e15458. Bibcode : 2010PLoSO...515458H . doi : 10.1371/journal.pone.0015458 . PMC 2994901. PMID 21152102 .  
  4. ^ Park, C.; Marqusee, S. (2005). 「パルスプロテオリシス：タンパク質の安定性とリガンド結合を定量的に測定する簡便法」Nature Methods . 2 (3): 207– 212. doi : 10.1038 / nmeth740 . PMID 15782190. S2CID 21364478 .  
  5. ^トゥール・アーランディス、G.ロドリゲス・ラレア、D.イバラ・モレロ、B.サンチェス・ルイス、JM (2010)。「タンパク質分解走査熱量測定: タンパク質の速度論的安定性の基本的な特徴を調べる新しい方法論」。生物物理学ジャーナル。98 (6)：L12～ L14。ビブコード: 2010BpJ....98L..12T。土井：10.1016/j.bpj.2009.11.028。PMC 2849053。PMID 20303845。  
  6. ^ a b Laemmli, UK (1970). 「バクテリオファージT4の頭部の組み立て過程における構造タンパク質の切断」. Nature . 227 ( 5259): 680– 685. Bibcode : 1970Natur.227..680L . doi : 10.1038/227680a0 . PMID 5432063. S2CID 3105149 .  
  7. ^ a b Leuenberger, P; Ganscha, S; Kahraman, A (2017). 「細胞全体にわたるタンパク質の熱変性解析により、熱安定性の決定因子が明らかになる」. Science . 355 ( 6327) eaai7825. doi : 10.1126/science.aai7825 . PMID 28232526. S2CID 8432125 .  
  8. ^ Demarest, SJ; Martinez-Yamout, M.; Chung, J.; Chen, H.; Xu, W.; Dyson, HJ ; Evans, RM; Wright, PE (2002). 「p160核内受容体コアクチベーターによるCBP/p300リクルートにおける相互相乗的フォールディング」Nature . 415 (6871): 549– 553. doi : 10.1038 / 415549a . PMID 11823864. S2CID 4423920 .  
  9. ^ a b Robaszkiewicz, K.; Ostrowska, Z.; Cyranka-Czaja, A.; Moraczewska, J. (2015). 「トロポミオシン–トロポニン相互作用の障害はアクチン細フィラメントの活性化を低下させる」Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics . 1854 (5): 381– 390. doi : 10.1016/j.bbapap.2015.01.004 . PMID 25603119 . 
  10. ^ Minde, DP; Anvarian, Z.; Rüdiger, SG; Maurice, MM (2011). 「Messing up disorder: How do missense mutations in the tumor suppressor protein APC lead to cancer?」 . Molecular Cancer . 10 101. doi : 10.1186/ 1476-4598-10-101 . PMC 3170638. PMID 21859464 .  
  11. ^トゥール・アーランディス、G.ロドリゲス・ラレア、D.イバラ・モレロ、B.サンチェス・ルイス、JM (2010)。「タンパク質分解走査熱量測定: タンパク質の速度論的安定性の基本的な特徴を調べる新しい方法論」。生物物理学ジャーナル。98 (6)：L12～ L14。ビブコード: 2010BpJ....98L..12T。土井：10.1016/j.bpj.2009.11.028。PMC 2849053。PMID 20303845。  
  12. ^ Minde, DP; Halff, EF; Tans, SJ (2013). 「無秩序のデザイン：予想外の尾部の物語」 .本質的に無秩序なタンパク質. 1 (1) e26790. doi : 10.4161/idp.26790 . PMC 5424805. PMID 28516025 .  
  13. ^ Chang, Y; Schlebach, JP; Verheul, RA; Park, C (2012). 「タンパク質-リガンド相互作用を発見するための簡略化されたプロテオミクスアプローチ」 . Protein Science . 21 (9): 1280–7 . doi : 10.1002/pro.2112 . PMC 3631357. PMID 22733688 .  
  14. ^ Park, C; Marqusee, S (2005). 「パルスプロテオリシス：タンパク質の安定性とリガンド結合を定量的に測定する簡便法」Nature Methods . 2 (3): 207–12 . doi : 10.1038/nmeth740 . PMID 15782190 . S2CID 21364478 .  
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