ミステリー・サイエンス・シアター3000では、放送開始以来、様々なキャラクターが登場し、また多くのゲストキャラクターも登場してきました。以下は、シリーズに登場するメインキャラクターとレギュラーキャラクターの一覧です。
| ミステリーサイエンスシアター3000のキャスト | |||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| キャラクター | KTMAシーズン(1988~1989年) | コメディチャンネル / コメディセントラルシーズン(1989–1996) | 映画(1996年) | SFシーズン(1997~1999年) | Netflixシーズン(2017~2018年) | ギズモプレックス シーズンズ(2022) | |||||||||||
| 「0」 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | ||||
| ジョエル・ロビンソン1 | ジョエル・ホジソン | ジョエル・ホジソン3 | ジョエル・ホジソン | ||||||||||||||
| マイク・ネルソン | マイケル・J・ネルソン | ||||||||||||||||
| ジョナ・ヘストン | ジョナ・レイ | ||||||||||||||||
| エミリー・コナー | エミリー・マーシュ | ||||||||||||||||
| クロウT.ロボット | ジョシュ・ワインスタイン トレース・ボーリュー | トレース・ボーリュー | ビル・コーベット | ハンプトン・ヨント | ハンプトン・ヨントケルシー・アン・ブレイディ | ||||||||||||
| トム・サーボ | ジョシュ・ワインスタイン | ケビン・マーフィー | バロン・ヴォーン | バロン・ヴォーン、コナー・マクギフィン、ジョシュ・ワインスタイン3 | |||||||||||||
| ジプシー / 石膏 / GPC / GPC2 | ジョシュ・ワインスタイン | ジム・マロン | パトリック・ブランツェグ | レベッカ・ハンソン | レベッカ・ハンソンイヴォンヌ・フリーズ | ||||||||||||
| M. ウェイバリー | グラント・バッチオッチョ | ||||||||||||||||
| グロウラー | ラス・ウォーコ | ||||||||||||||||
| クレイトン・フォレスター博士 | トレース・ボーリュー | ||||||||||||||||
| ローレンス・エアハート博士 | ジョシュ・ワインスタイン | ジョシュ・ワインスタイン3 | ジョシュ・ワインスタイン | ||||||||||||||
| テレビのフランク2 | フランク・コニフ | フランク・コニフ3 | |||||||||||||||
| パール・フォレスター | メアリー・ジョー・ペール3 | メアリー・ジョー・ペール | メアリー・ジョー・ペール | メアリー・ジョー・ペール3 | メアリー・ジョー・ペール | ||||||||||||
| ボボ教授 | ケビン・マーフィー | ケビン・マーフィー3 | |||||||||||||||
| オブザーバー/ブレインガイ | ビル・コーベット | ビル・コーベット3 | |||||||||||||||
| キンガ・フォレスター | フェリシア・デイ | ||||||||||||||||
| マックス(テレビのフランクの息子) | パットン・オズワルト | ||||||||||||||||
| アーディ | ジョエル・ホジソン | ||||||||||||||||
| シンシア | レベッカ・ハンソン | ||||||||||||||||
| メガシンシア | イヴォンヌ・フリーズ | ||||||||||||||||
カムボットは番組の全期間を通じてレギュラーキャラクターとして登場するが、出演者はいない。