ビシンコニン酸アッセイ

96ウェルプレートでのBCAタンパク質アッセイ

ビシンコニン酸アッセイ（BCAアッセイ）は、ピアスケミカル社のポール・K・スミス氏にちなんでスミスアッセイとも呼ばれ、^{[ 1 ]} 、溶液中のタンパク質の総濃度（0.5μg/mL～1.5mg/mL）を測定する生化学アッセイであり、ローリータンパク質アッセイ、ブラッドフォードタンパク質アッセイ、ビウレット試薬に類似しています。総タンパク質濃度は、タンパク質濃度に比例してサンプル溶液の色が青から紫に変化することで示され、比色法を用いて測定することができます。BCAアッセイは1989年にピアスケミカル社によって特許を取得しましたが、特許は2006年に失効しました。^{[ 2 ]}

機構

BCA ストック溶液には、 pH 11.25の高アルカリ性溶液に、ビシンコニン酸、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、および硫酸銅 (II)五水和物という成分が含まれています。

BCAアッセイは主に2つの反応に基づいています。まず、タンパク質中のペプチド結合が硫酸銅(II)中のCu ^{2+イオンをCu 1+に}還元します（温度依存反応）。還元されるCu ²⁺の量は、溶液中に存在するタンパク質の量に比例します。次に、ビシンコニン酸2分子が各Cu ¹⁺イオンとキレート結合し、波長562 nmの光を強く吸収する紫色の錯体を形成します。

ビシンコニン酸Cu ¹⁺複合体は、タンパク質サンプル中のシステイン/シスチン、チロシン、トリプトファン側鎖の存在によって影響を受けます。高温（37～60℃）では、ペプチド結合が反応複合体の形成を助けます。BCAアッセイを高温でインキュベートすることは、アミノ酸組成の不均一性による変動を最小限に抑えながらアッセイ感度を向上させる方法として推奨されます。^{[ 3 ]}

溶液中に存在するタンパク質の量は、吸収スペクトルを測定し、既知の濃度のタンパク質溶液と比較することによって定量化できます。

制限事項

BCAアッセイは、還元剤や金属キレート剤とはほとんど互換性がありませんが、微量であれば許容される場合があります。^{[ 4 ]} BCAアッセイは、一般的な膜脂質やリン脂質にも反応すると報告されています。^{[ 5 ]}

アッセイバリアント

BCA アッセイにはいくつかの代替バリエーションがあります。

オリジナルBCAアッセイ

スミス氏によると、^{[ 1 ]}オリジナルのBCAアッセイは2成分プロトコルです。2つの試薬は「室温で無期限に安定」です。^{[ 1 ]}最新の（おそらく全く同じ、あるいは非常に類似した）製剤は、少なくとも2つの市販業者から入手可能です。^{[ 6 ] [ 7 ]} BCAワーキング溶液は、試薬Aと試薬Bを50:1の比率で混合することで生成され、毎週（中程度に安定）または必要に応じて調製できます。

試薬A ^{[ 1 ]}

• 1% w/v BCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4)
• 2% w/v Na ₂ CO ₃・H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
• 0.16% w/v酒石酸Na ₂ (CAS: 868-18-8)
• 0.4% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
• 0.95% w/v NaHCO ₃ (CAS: 144-55-8)
• 50% NaOHまたは固体NaHCO ₃を加えてpHを11.25に調整します。

スミスの原稿で提案されているがテストされていない代替処方は、NaOHを省略し（おそらく手動でpHを11.25に調整しない）、代わりに0.25 M Na ₂ CO ₃と0.01 M NaHCO ₃の調製済み緩衝液に他の成分を溶かすというものである。^{[ 1 ]}

注目すべきことに、スミスはイサチンとアセトインのフィッツィンガー反応によって独自のBCAを合成しました。KOHの代わりにNaOHを使用しましたが、それ以外はレセンとヘンゼの合成法に従っていました^{[ 8 ]}。当時市販されていたBCAは純度が低すぎたため、スミスはBCAを分析に十分な純度にするために、70℃の水から少なくとも3回連続して再結晶する必要がありました^{[ 1 ] 。}

試薬B ^{[ 1 ]}

• 4% w/v CuSO ₄ ·5H ₂ O

マイクロBCAアッセイ（希薄溶液用）

BCAマイクロBCAアッセイは、ビウレット反応、BCA、銅(II)試薬の濃縮ストックを使用する3成分プロトコルです。従来のBCAアッセイの20～2000 μg/mLに対して、2～40 μg/mLまで感度が向上します。しかし、非タンパク質成分からの干渉は異なり、一般的に感度が高いとされています。^{[ 4 ]}マイクロBCAアッセイのキットは、少なくとも2社の市販ベンダーから入手可能です。^{[ 9 ] [ 10 ]}特筆すべきは、「マイクロBCA試薬およびプロトコル」の組成と使用法がスミスの原著論文に記載されており、^{[ 1 ]}現代のキットは、おそらく全く同じ、あるいは非常に類似した組成で構成されているということです。プロトコルは、マイクロ試薬Bと銅溶液を25:1の割合で混合してマイクロ試薬C（MC）を作成するというものです。この試薬Cは保存安定性がないため、新しく調製する必要があります。次に、MCをマイクロ試薬Aと1:1の割合で混合して、最終的な（これも不安定な）アッセイ用溶液を作成します。マイクロ試薬A、マイクロ試薬B、および銅溶液は室温で無期限に安定です。^{[ 1 ]}

マイクロ試薬A（MA）^{[ 1 ]}

• 8% w/v Na ₂ CO ₃・H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
• 1.6% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
• 1.6% w/v Na ₂酒石酸（CAS: 868-18-8）（上記オリジナルBCAアッセイの試薬Aの10倍濃度）
• _pHを11.25に調整するのに十分なNaHCO3（CAS：144-55-8）

マイクロ試薬B（MB）^{[ 1 ]}

• 4% w/v BCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4) (上記オリジナルBCAアッセイの試薬Aの4倍濃度)

銅溶液^{[ 1 ]}

• 4% w/v CuSO ₄ ·5H ₂ O (CAS: 7758-99-8) (上記のオリジナルBCAアッセイの試薬Bと同じ濃度)

還元剤適合性（RAC）BSAアッセイ

このタイプのBCAアッセイには、独自のチオール共有結合ブロッキング「適合性試薬」^{[ 11 ]}（還元剤適合性試薬（RACA）とも呼ばれる）が含まれています。^{[ 12 ]}これにより還元剤との適合性が向上しますが、このアッセイは他の非タンパク質成分とは異なる干渉プロファイルを持っています。^{[ 4 ]}

ラピッドゴールドBCA

このタイプのBCAアッセイは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社からのみ入手可能なようです。報道によると、このアッセイは「従来のBCAタンパク質アッセイと同じ銅還元法に、独自の（特許取得済みの）銅キレート剤を用いた」もので、562 nmではなく480 nmで吸収します。^{[ 13 ]}この特許取得済みのキレート剤と、おそらく最適化されたビウレット反応処方により、このアッセイは、従来のBCAアッセイで必要だった37℃以上のインキュベーションなしで、迅速な（5分未満）結果を得ることができます。しかし、このアッセイは、他の非タンパク質成分とは異なる干渉プロファイルを持っています。^{[ 4 ]} Pierce定量比色ペプチドアッセイ（現在はサーモフィッシャーサイエンティフィック社が所有し、同社から入手可能）は、類似または同一の480 nm吸収を持つ特許取得済みの銅キレート剤を使用しているようです。^{[ 14 ]}

参照

• ビウレット試験
• ブラッドフォードアッセイ
• 金コロイドタンパク質アッセイ

参考文献

1. Smith, PK; et al. (1985). 「ビシンコニニック酸を用いたタンパク質測定」. Anal. Biochem . 150 (1): 76– 85. doi : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . PMID  3843705 .
2. 「US4839295A - ビシンコニニック酸を用いたタンパク質の測定」 Google Patents 1987年5月26日2023年4月9日閲覧。
3. Olsen BJ, Markwell J (2007). 「タンパク質濃度測定のためのアッセイ」(PDF) . Current Protocols in Protein Science : 14–17 .
4. Fisher Scientific, Thermo. 「タンパク質定量アッセイ適合性表」（PDF） . 2023年4月19日閲覧。
5. Kessler, Ralph J.; Fanestil, Darrell D. (1986). 「ビシンコニン酸を用いたタンパク質測定における脂質の干渉」.分析生化学. 159 (1). Elsevier BV: 138– 142. doi : 10.1016/0003-2697(86)90318-0 . ISSN 0003-2697 . PMID 3812993 .  
6. Fisher Scientific, Thermo. 「Pierce BCA タンパク質アッセイキット - ユーザーマニュアル」（PDF） . 2023年4月22日閲覧。
7. Biosciences, G-. 「ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF） . 2023年4月22日閲覧。
8. Lesesne、シャーマン D.;ヘンツェ、ヘンリー R. (1942)。 「プフィツィンガー反応によるキノリンの合成におけるアルコキシケトンの利用。II1」。アメリカ化学会誌。64（8）。アメリカ化学会 (ACS): 1897 ～ 1900 年。doi : 10.1021 /ja01260a041。ISSN 0002-7863。 
9. Fisher Scientific, Thermo. 「Micro BCA Protein Assay Kit - 説明書」(PDF) . 2023年4月22日閲覧。
10. Biosciences, G-. 「マイクロビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF）。
11. Fisher Scientific, Thermo. 「Pierce Microplate BCA-RAC Protein Assay Kit - ユーザーマニュアル」（PDF） . 2023年4月22日閲覧。
12. Biosciences, G-. 「ビシンコニン酸（BCA）還元剤適合タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF） . 2023年4月22日閲覧。
13. Fisher Scientific, Thermo. 「Pierce Rapid Gold BCA タンパク質アッセイキット - ユーザーガイド」（PDF） . 2023年4月22日閲覧。
14. Fisher Scientific, Thermo. 「Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay - ユーザーマニュアル」（PDF） . Thermo Fisher Scientific . 2023年7月19日閲覧。

• Wiechelman, K.; Braun, R. & Fitzpatrick, J. (1988). 「ビシンコニニン酸タンパク質アッセイの検討：発色に関与する基の同定」. Anal. Biochem . 175 (1): 231–7 . doi : 10.1016/0003-2697(88)90383-1 . PMID  3245570 .
• ストスチェック, CM. (1990). "6".タンパク質の定量. 酵素学の方法. 第182巻. pp.  50– 69. doi : 10.1016/0076-6879(90)82008-P . ISBN 9780121820831. PMID  2314256 .

外部リンク

• オープンウェットウェア
• BCAアッセイ化学