CRISPR活性化

CRISPR活性化（CRISPRa ）は、 CRISPR-Cas9システムの改変型を利用して、基礎となるDNA配列を変更することなく特定の遺伝子の発現を増強する遺伝子調節技術である。遺伝子編集のために二本鎖切断を導入する従来のCRISPR-Cas9とは異なり、 CRISPRaは、転写活性化因子と融合した改変された触媒不活性Cas9 （ dCas9）を用いてプロモーター領域またはエンハンサー領域を標的とし、遺伝子転写を促進する。この方法は遺伝子発現の正確な制御を可能にし、遺伝子機能の研究、遺伝子調節ネットワークの構築、そして様々な疾患に対する潜在的な治療介入の開発のための貴重なツールとなっている。[ 1 ]

CRISPR干渉と同様に、CRISPRエフェクターは相補的なガイドRNAによって標的へと誘導されます。一方、CRISPR活性化システムは転写活性化因子と融合され、目的遺伝子の発現を増加させます。このようなシステムは、遺伝子スクリーニングや目的タンパク質の過剰発現など、様々な目的に使用できます。最も一般的に使用されるエフェクターはCas9 （タイプIIシステム由来）に基づいていますが、 Cas12a （タイプVシステム由来）などの他のエフェクターも使用されています。[ 2 ]

コンポーネント

dCas9

Cas9 Endonuclease Deadは、dead Cas9またはdCas9とも呼ばれ、エンドヌクレアーゼドメインの点突然変異によってエンドヌクレアーゼ活性が除去されたCas9の変異体です。変異していない形式と同様に、dCas9はCRISPRシステムでgRNAとともに使用され、Cas9が結合できるPAM配列を持つgRNAに相補的な特定の遺伝子またはヌクレオチドを標的とします。Cas9は通常、RuvCドメインとHNHドメインと呼ばれる2つのエンドヌクレアーゼドメインを持っています。点突然変異D10AとH840Aは、エンドヌクレアーゼ活性にとって重要な2つの残基を変化させ、最終的に不活性化をもたらします。dCas9はエンドヌクレアーゼ活性を欠いていますが、そのような結合は他のドメインによって管理されているため、依然としてガイドRNAおよび標的のDNA鎖に結合することができます。 gRNAがdCas9を転写因子やRNAポリメラーゼがDNAにアクセスできないように配置すれば、標的遺伝子の転写を完全に阻害しなくても、弱めるのに十分な場合が多い。しかし、dCas9には転写活性化因子を付加できる修飾領域（典型的にはタンパク質のN末端とC末端）があるため、このDNA結合能力は転写活性化にも利用できる。[ 3 ]

ガイドRNA

参照:ガイドRNA、CRISPR

sgRNAとゲノムDNA間の相補的塩基対合により、Cas9またはdCas9の標的化が可能になる。
sgRNAとゲノムDNA間の相補的塩基対合により、Cas9またはdCas9の標的化が可能になる。

スモールガイドRNA（sgRNA）、またはgRNAは、約20ヌクレオチドのRNAで、Cas9またはdCas9を標的に誘導するために使用されます。gRNAには、CRISPRシステムにとって重要な2つの主要な領域、すなわちスキャフォールド領域とスペーサー領域が含まれています。スペーサー領域には、標的遺伝子（多くの場合、プロモーター領域）に見られるヌクレオチドと相補的なヌクレオチドが含まれます。スキャフォールド領域は、（d）Cas9との複合体の形成を担います。これらは一緒になって（d）Cas9に結合し、目的の遺伝子に誘導します。gRNAのスペーサー領域は任意の潜在的な配列に合わせて改変できるため、スペーサー領域に相補的な配列を持つあらゆる遺伝子とヌクレオチドが標的となる可能性があり、CRISPRシステムの柔軟性が大幅に向上します。[ 3 ]

転写活性化因子

参照:転写活性化因子、転写因子

転写活性化因子は、dCas9 または sgRNA に結合したタンパク質ドメインまたはタンパク質全体であり、システムの標的遺伝子の転写のためにRNA ポリメラーゼだけでなく重要な補因子のリクルートを補助します。遺伝子からタンパク質が作られるためには、RNA ポリメラーゼが転写と呼ばれるプロセス中に遺伝子の DNA テンプレートから RNA を作らなければなりません。転写活性化因子は、DNA 結合ドメインと転写を活性化するためのドメインを持っています。活性化ドメインは、一般的な転写因子または RNA ポリメラーゼを遺伝子配列にリクルートすることができます。活性化ドメインは、停止した RNA ポリメラーゼによる転写を促進することによっても機能し、真核生物ではDNA 上のヌクレオソームを移動させたり、ヒストンを改変して遺伝子発現を増加させたりする働きがあります。[ 4 ]これらの活性化因子は、dCas9 または sgRNA への結合によってシステムに導入できます。一部の研究者は、1つの実験で複数の活性化因子結合部位を使用することによって、また、特定の実験またはサンプルで異なるバリエーションおよび組み合わせの活性化因子を一度に使用することによって、転写上方制御の程度を調節できることを指摘している。[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]

発現システム

gRNAおよび(d)Cas9タンパク質を目的細胞に導入するには、発現系が必要です。一般的に用いられる発現系としては、プラスミドやアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられますが、これらに限定されるものではありませ ん。

特定の活性化システム

VP64-p65-Rta

dCas9-VPR アクティベーターは、標的とする遺伝子の転写を増加させます。

VP64-p65-Rta（VPR）dCas9活性化因子は、既存のdCas9活性化因子を改変して作成され、Vp64転写活性化因子がdCas9のC末端に連結されている。[ 1 ] dCas9-VPRタンパク質では、転写因子p65とRtaがdCas9-Vp64のC末端に付加されている。したがって、3つの転写因子すべてが同じ遺伝子を標的とする。Vp64のみではなく、3つの転写因子を使用することで、標的遺伝子の発現が増加する。dCas9が異なる遺伝子を標的とした場合、それらはすべてdCas9-VP64よりもdCas9-VPRで有意に高い発現を示した。また、複数のsgRNAを同一細胞に導入することで、dCas9-VPRを用いて同一細胞内の複数遺伝子の発現を増強できることも実証されている。[ 8 ]

dCas9-VPRは、ニューロジェニン2（リンク）および神経分化1（リンク）遺伝子を活性化するために使用されており、誘導多能性幹細胞を誘導ニューロンに分化させます。[ 8 ] dCas9活性化因子を比較した研究では、VPR、SAM、およびSuntag活性化因子がdCas9と最もよく連携して、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトのさまざまな細胞型で遺伝子発現を増加させることがわかりました。[ 9 ]

相乗活性化メディエーター

dCas9-VP64遺伝子活性化システムの限界を克服するために、複数の転写因子を組み込んだdCas9-SAMシステムが開発されました。dCas9 -SAMシステムは、 MS2、p65、HSF1タンパク質を利用し、相乗的に作用する様々な転写因子をリクルートすることで、目的遺伝子を活性化します。

dCas-SAM システムは、さまざまな転写因子 (MS2、p65、HSF1) に結合するアプタマーが付着した msgRNA を使用します。

dCas9-SAMシステムは、様々な転写活性化因子を組み立てるために、MS2タンパク質への結合部位を有する改変シングルガイドRNA（sgRNA）を使用します。ヘアピンアプタマーはsgRNAのテトラループとステムループ2に付加され、二量体化したMS2バクテリオファージコートタンパク質の結合部位となります。ヘアピンはdCas9-sgRNA複合体の外側に露出しているため、他の転写因子はdCas9-sgRNA複合体を阻害することなくMS2タンパク質に結合できます。このようにして、MS2タンパク質はp65タンパク質とHSF1タンパク質を含むように設計されます。MS2-p65-HSF1融合タンパク質はdCas9-VP64と相互作用し、標的遺伝子のプロモーター上により多くの転写因子をリクルートします。

Konermannら（2015）はdCas9-SAMシステムを用いて、メラノーマ細胞においてBRAF阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子を特定した。[ 7 ]別の研究では、Zhangら（2015）はヒト細胞株においてdCas-SAMシステムを用いて潜伏HIVプロウイルスを再活性化し、感染細胞のアポトーシスを誘発した。[ 10 ]

サンタグ

Suntagシステムを用いることで、VP64に融合された複数の抗体がdCas9-Suntagに結合することが可能になります。これによりRNAポリメラーゼがリクルートされ、遺伝子発現が増加します。

SunTagアクティベーターシステムは、SunTagに結合できるように改変されたdCas9タンパク質を使用します。SunTagは、抗体の複数のコピーをリクルートできる反復ポリペプチドアレイです。抗体に転写因子を付加することで、SunTag dCas9活性化複合体は転写因子のリクルートを増幅します。dCas9タンパク質を標的遺伝子に誘導するために、dCas9 SunTagシステムはsgRNAを使用します。

Tanenbaumら(2014)は、dCas9 SunTagシステムを作成したことで知られています。[ 11 ]抗体には、転写因子VP64に結合したGCN4抗体を使用しました。細胞の核に抗体を輸送するために、NLSタグを取り付けました。抗体の核局在を確認するために、sfGFPが視覚化の目的で使用されました。したがって、dCas SunTagシステムと相互作用するGCN4-sfGFP-NLS-VP64タンパク質が開発されました。抗体はSunTagポリペプチドにうまく結合し、K562細胞株で標的CXCR4遺伝子を活性化しました。[ 11 ] dCas9-VP64活性化複合体と比較して、K562細胞株でCXCR4遺伝子発現を5〜25倍増加させることができました。 CXCR4タンパク質の過剰発現が増加しただけでなく、CXCR4タンパク質はトランスウェル移動アッセイにおいて活性化され、さらに移動しました。したがって、dCas9-SunTagシステムは、ウイルス遺伝子など、潜在的に存在する遺伝子を活性化するために使用できます。

アプリケーション

dCas9活性化システムは、同一細胞内の所望の遺伝子または複数の遺伝子の発現を可能にする。遺伝子発現を活性化するゲノムワイドスクリーニングを用いることで、特定のプロセスに関与する遺伝子を研究することが可能になる。どのsgRNAが表現型を生成するかを調べることで、特定の経路に関与する遺伝子を示唆することができる。dCas9活性化システムは、どの細胞が活性化され、いつ活性化が起こるかを正確に制御するために用いることができる。光または化学物質の存在下でdCas9活性化因子融合タンパク質を活性化するdCas9コンストラクトが作製されている。また、細胞型の形成または維持に重要な特定の遺伝子の発現を増加させることによって、細胞を再プログラムしたり、ある細胞型から別の細胞型へと分化させたりすることもできる。[ 12 ]

遺伝子発現のより優れた制御

ある研究グループは、dCas9を特定のドメインC1B1に融合したシステムを使用しました。青色光が細胞に照射されると、クリプトクロム2（Cry2）ドメインがC1B1に結合します。Cry2ドメインは転写活性化因子に融合されているため、青色光は活性化因子をdCas9が結合した場所に誘導します。光の使用により、標的遺伝子が活性化されるタイミングを高度に制御できます。細胞から光を取り除くと、標的遺伝子にはdCas9のみが残るため、発現は増加しません。このように、このシステムは可逆的です。[ 13 ]同様のシステムが化学物質の制御を使用して開発されました。このシステムでは、dCas9はドメインFKBPを含むMS2融合タンパク質をリクルートします。化学物質RAPの存在下では、クロマチン修飾複合体に融合されたFRBドメインがFKBPに結合します。 RAPを細胞に加えるたびに、特定のクロマチン修飾複合体が遺伝子を標的とすることができます。これにより、科学者は特定のクロマチン修飾が遺伝子の発現にどのように影響するかを調べることができます。[ 14 ] dCAs9-VPRシステムは、遺伝子のコード領域の上流にあるプロモーターを標的とすることで、活性化因子として使用されます。ある研究では、様々なsgRNAを用いて遺伝子の異なる部分を標的とし、dCas9-VPR活性化因子は結合部位に応じて活性化因子または抑制因子として作用することがわかりました。細胞内では、プロモーターを標的とするsgRNAはdCas9-VPRの発現を増加させる可能性がありますが、遺伝子のコード領域を標的とするsgRNAはdCas9-VPRの発現を減少させます。[ 15 ]

ゲノムワイド活性化

sgRNAの汎用性により、dCas9活性化因子は生物のゲノム内の任意の遺伝子の発現を増加させることができます。これは、タンパク質コード遺伝子または転写されたRNAの発現を増加させるために使用できます。ある論文では、ゲノム全体の活性化を使用して、特定の薬剤に対する媒介耐性に関与するタンパク質を特定できることが実証されました。[ 7 ]別の論文では、長い非コードRNAのゲノム全体の活性化を使用し、特定の長い非コードRNAの発現の増加が薬剤ベムラフェニブに対する耐性を付与することを観察しました。[ 16 ]どちらの場合も、薬剤を生き延びた細胞を調べて、それらに含まれるsgRNAを特定できます。これにより、研究者は生き残った各細胞でどの遺伝子が活性化されたかを特定でき、どの遺伝子がその薬剤に対する耐性に重要であるかを示唆します。

生物における使用

VP64、p65、 HSF1 （熱ショック因子1）とのdCas9融合により、研究者はシロイヌナズナの遺伝子を標的とし、遺伝子自体を植物のゲノムに挿入した場合と同程度まで転写を増加させることができました。試験した2つの遺伝子のうち1つでは、dCas9活性化因子が葉の数とサイズを変化させ、植物の干ばつへの耐性を高めました。著者らは、dCas9活性化因子は、過剰発現のために導入遺伝子を挿入した場合に観察されるものと同様の表現型を植物に作り出すことができると結論付けています。[ 17 ]研究者らは、複数のガイドRNAを使用して、特定のマウス系統の複数の遺伝子にdCas9活性化システムを標的としました。このマウス系統では、 Creリコンビナーゼシステムを使用して特定の細胞株でdCas9を活性化することができます。科学者らは、いくつかの遺伝子の標的化と発現増加を利用して、肝臓の再生と癌に関与するプロセスを調べました。[ 18 ]

参考文献

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