RNA-Seqの概要。生物体内で遺伝子は転写され、（真核生物では）スプライシングによって成熟mRNA転写産物（赤）が生成される。mRNAは生物体から抽出され、断片化されて安定したds-cDNA（青）にコピーされる。ds-cDNAは、ハイスループットのショートリードシーケンシング法を用いて配列決定される。これらの配列を参照ゲノム配列とアライメントすることで、どのゲノム領域が転写されていたかを再構築することができる。このデータは、発現遺伝子の位置、相対的な発現レベル、および選択的スプライスバリアントをアノテーションするために使用できる。[1]

RNA-Seq （ RNAシーケンシングの略）は、生物学的サンプル中のRNA分子を定量化および識別するために使用される次世代シーケンシング（NGS）技術であり、特定の時点のトランスクリプトームのスナップショットを提供します。 [2] RNA由来のcDNAをシーケンシングすることにより、トランスクリプトーム全体の分析が可能になります。[3]現代のワークフローには、多くの場合、擬似アライメントツール（KallistoやSalmonなど）とクラウドベースの処理パイプラインが組み込まれており、速度、スケーラビリティ、再現性が向上しています。

RNA-Seqにより、選択的遺伝子スプライシング転写産物、転写後修飾、遺伝子融合、突然変異/ SNP 、経時的な遺伝子発現の変化、または異なるグループや治療法における遺伝子発現の差異を調べることができます。 [4] mRNA転写産物に加えて、RNA-Seqは、トータルRNA、 miRNA、tRNAなどの小さなRNA 、リボソームプロファイリングを含むさまざまなRNA集団を調べることができます。[5] RNA-Seqは、エクソン/イントロン境界を決定し、以前に注釈を付けた 5'および3'遺伝子境界を確認または修正するためにも使用できます。 RNA-Seqの最近の進歩には、単一細胞シーケンシング、バルクRNAシーケンシング、[6] 3' mRNAシーケンシング、固定組織のin situシーケンシング、および単一分子リアルタイムシーケンシングによるネイティブRNA分子シーケンシング[7]があります。[8]バイオインフォマティクスアルゴリズムの進歩により出現したRNA-Seqアプリケーションの他の例としては、コピー数の変化、微生物汚染、転移因子、細胞型（デコンボリューション）、および新抗原の存在などがある。[9]

歴史

PubMedの論文一致は、RNA-Seqの人気の高まりを浮き彫りにしています。一致はRNA-Seq（青、検索語：「RNA Seq」または「RNA-Seq」または「RNA sequencing」または「RNASeq」）[10]と医学におけるRNA=Seq（金、検索語：「（RNA Seq」または「RNA-Seq」または「RNA sequencing」または「RNASeq」）AND「Medicine」）です[11] 。PubMedにおけるRNA-Seqに関する論文数は依然として増加しています。

RNA-Seqが登場する以前は、遺伝子発現研究はハイブリダイゼーションベースのマイクロアレイを用いて行われていました。マイクロアレイの問題点としては、クロスハイブリダイゼーションアーティファクト、低発現遺伝子と高発現遺伝子の定量精度の低さ、そして事前に配列を知る必要があることなどが挙げられます。[12]これらの技術的問題のため、トランスクリプトミクスはシーケンシングベースの手法へと移行しました。これらの手法は、発現配列タグライブラリのサンガーシーケンシングから、化学タグベースの手法（例：遺伝子発現の連続解析）へと進化し、最終的に現在の技術である相補DNA （cDNA）の次世代シーケンシング、特に2000年代半ばのRNA-Seqへと発展しました。[13]

RNA-Seqという用語を使わずに初めて使用した論文としては、前立腺がん 細胞株[14]（2006年）、ウマゴヤシ[15]（2006年）、トウモロコシ[16]（2007年）の論文などがあり、「RNA-Seq」という用語自体は2008年に初めて使用されました。[7] [17] [18]タイトルや抄録でRNA-Seqに言及する論文の数は継続的に増加しており（図、青線）、2018年には6754本の論文が発表されました。RNA-Seqと医療の交差点（図、金線）も同様の勢いで増加しています。[19]

方法

ライブラリの準備

典型的なRNA-Seq実験ワークフロー。複数のサンプルからRNAを単離し、cDNAライブラリに変換し、コンピュータ読み取り可能な形式に配列決定し、リファレンスにアラインメントし、差次的発現や選択的スプライシングなどの下流解析のために定量化する。典型的なRNA-Seq実験ワークフローの概要。[20]

シーケンシング用の相補DNA （cDNA）ライブラリを準備するための一般的な手順は以下に説明しますが、プラットフォームによって異なる場合があります。[20] [3] [21]

  1. RNA分離： RNAを組織から分離し、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）と混合します。DNaseはゲノムDNAの量を減らします。RNAの分解量はゲル電気泳動とキャピラリー電気泳動で確認され、サンプルにRNA完全性番号（RNA integrity number）を割り当てます。このRNAの品質と開始時のRNAの総量は、その後のライブラリ調製、シーケンシング、および解析の各ステップで考慮されます。
  2. RNAの選択/除去:目的のシグナルを分析するために、単離されたRNAをそのまま保持するか、真核生物のmRNAのみを含むように3'ポリアデニル化(ポリ(A))テールを持つRNAを濃縮するか、リボソームRNA (rRNA)を除去、および/または特定の配列に結合するRNAをフィルター処理することができます(以下のRNA選択および除去方法の表)。真核生物の3'ポリ(A)テールを持つRNA分子は、主に成熟し、処理されたコード配列で構成されています。ポリ(A)選択は、RNAを、通常は磁性ビーズなどの基質に共有結合したポリ(T)オリゴマーと混合することによって行われます。[22] [17]ポリ(A)選択は、RNAバイオタイプ検出において重要な制限があります。多くのRNAバイオタイプはポリアデニル化されておらず、これには多くの非コードRNAとヒストンコアタンパク質転写産物が含まれますが、ポリ(A)テールの長さによって制御されているため(サイトカインなど)、ポリ(A)選択後に検出されない可能性があります。[23]さらに、ポリ(A)選択では、特に低品質のRNAの場合、3'バイアスが増加する可能性があります。[24] [25]これらの制限は、細胞内のRNAの90%以上を占めるrRNAを除去するリボソーム除去によって回避できます。ポリ(A)濃縮とリボソーム除去のどちらの手順も労働集約的であり、バイアスを導入する可能性があるため、これらの手順を省略するより簡単な方法が開発されました。[26] miRNAなどの小さなRNAターゲットは、排除ゲル、磁気ビーズ、または市販のキットを使用したサイズ選択によってさらに分離できます。
  3. cDNA合成： RNAはcDNAに逆転写されます。これはDNAの方が安定しており、増幅（DNAポリメラーゼを使用）を可能にし、より成熟したDNAシーケンシング技術を活用するためです。逆転写後の増幅により鎖構造が失われますが、これは化学標識や一分子シーケンシングによって回避できます。シーケンシングマシンに適した長さの配列を精製するために、断片化とサイズ選択が行われます。RNA、cDNA、またはその両方が、酵素、超音波処理、二価イオン、またはネブライザーで断片化されます。RNAの断片化により、ランダムプライム逆転写の5'バイアスとプライマー結合部位の影響が減少しますが、[17] 5'末端と3'末端がDNAに変換される効率が低下するという欠点があります。断片化の後にはサイズ選択が続き、小さな配列が除去されるか、狭い範囲の配列長が選択されます。miRNAなどの小さなRNAは失われるため、これらは個別に分析されます。各実験の cDNA は、ヘキサマーまたはオクタマー バーコードでインデックス付けできるため、これらの実験を 1 つのレーンにプールして、マルチプレックス シーケンスを行うことができます。

相補DNAシーケンシング（cDNA-Seq）

次に、RNAバイオタイプから得られたcDNAライブラリーは、コンピューターで読み取り可能な形式に配列決定される。cDNAシーケンシングには、Illumina、Thermo Fisher、BGI/MGI、PacBio、およびOxford Nanopore Technologiesが開発したプラットフォームを含め、多くのハイスループットシーケンシング技術がある。[27] cDNAシーケンシングの一般的な技術であるIlluminaのショートリードシーケンシングでは、アダプターがcDNAにライゲートされ、DNAがフローセルに結合し、ブリッジ増幅と変性のサイクルによってクラスターが生成され、相補鎖合成と可逆的ターミネーターによる塩基のレーザー励起のサイクルでシーケンスバイシンセシスが実行される。シーケンシングプラットフォームの選択とパラメータは、実験デザインとコストによって決まる。一般的な実験デザインの考慮事項には、シーケンス長、シーケンス深度、シングルエンドシーケンシングとペアエンドシーケンシングの使用、反復数、マルチプレックス化、ランダム化、およびスパイクインの決定が含まれる。[28]

まず、細胞からmRNAを抽出し、より小さなmRNA配列に断片化した後、逆転写反応を行います。得られたcDNAは、次世代シーケンシング（NGS）プラットフォームで配列決定されます。この配列決定の結果から、トランスクリプトームシーケンシングゲノムマップを作成することができます。
実験的トランスクリプトーム配列解析技術 (RNA-seq)。

低分子RNA/非コードRNAシーケンシング

mRNA以外のRNAをシーケンシングする場合は、ライブラリ調製法が異なります。細胞内RNAは、目的のサイズ範囲に基づいて選択されます。miRNAなどの小さなRNA標的の場合、 RNAはサイズ選択によって単離されます。これは、サイズ排除ゲル、サイズ選択磁気ビーズ、または市販のキットを用いて行うことができます。単離後、3'末端と5'末端にリンカーを付加し、精製します。最終段階は、逆転写による cDNA合成です。

直接RNAシーケンシング

RNAからcDNAへの変換、ライゲーション、増幅、その他のサンプル操作は、転写産物の適切な特性評価と定量化の両方を妨げる可能性のあるバイアスやアーティファクトを導入することが示されているため、[29] Helicos（破産）、Oxford Nanopore Technologies [ 30]などの企業によって、単一分子の直接RNAシーケンシングが研究されてきました。この技術は、RNA分子を超並列的に直接シーケンシングします。

単一分子リアルタイムRNAシーケンシング

大規模並列単一分子ダイレクトRNA-Seqは、RNAからcDNAへの変換、ライゲーション、増幅、およびその他のサンプル操作ステップによってバイアスやアーティファクトが導入される可能性がある従来のRNA-Seqの代替として研究されてきました。[31]単一分子リアルタイムRNA-Seqを実行する技術プラットフォームには、オックスフォードナノポアテクノロジー（ONT） ナノポアシーケンシングがあります。[30] RNAをネイティブ形式でシーケンシングすると、メチル化などの変更が保持されるため、直接かつ同時に調査できます。[30]単一分子ダイレクトRNA-Seqのもう1つの利点は、転写産物を全長でカバーできるため、ショートリードシーケンシングと比較して、より信頼性の高いアイソフォーム検出と定量化が可能になることです。 従来、単一分子RNA-Seq法はショートリードシーケンシングと比較してエラー率が高かったが、ONTダイレクトRNA-Seqなどの新しい方法ではエラー率が低減しています。最近、ヒト細胞集団における差次的発現にONT直接RNA-Seqが使用され、この技術が短いcDNAと長いcDNAのシーケンシングの多くの限界を克服できることが実証されました。[32]

シングルセルRNAシーケンシング（scRNA-Seq）

マイクロアレイや標準的なバルクRNA-Seq解析などの標準的な手法は、大規模な細胞集団からのRNA発現を解析します。混合細胞集団では、これらの測定では集団内の個々の細胞間の重要な差異が不明瞭になる可能性があります。[33] [34]

単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-Seq）は、個々の細胞の発現プロファイルを提供します。利用可能な材料の量が少ないため、各細胞が発現するすべてのRNAに関する完全な情報を得ることはできませんが、遺伝子クラスタリング解析を通じて遺伝子発現パターンを特定することができます。これにより、細胞集団内にこれまで見られなかった希少な細胞型が存在することが明らかになる可能性があります。例えば、 2018年には、肺気道上皮細胞に対してscRNA-Seqを行った2つのグループによって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子を発現する肺イオン化細胞と呼ばれる希少な特殊細胞が特定されました。[35] [36]

実験上の考察

RNA-Seq 実験を設計および実施する際には、 さまざまなパラメータが考慮されます。

  • 組織特異性：遺伝子発現は組織内および組織間で変動し、RNA-Seqは多様な細胞種を混合して測定します。そのため、対象となる生物学的メカニズムの分離が困難になる場合があります。シングルセルシーケンシングは個々の細胞を個別に研究できるため、この問題を軽減できます。
  • 時間依存性：遺伝子発現は時間とともに変化しますが、RNA-Seqはスナップショットのみを取得します。トランスクリプトームの変化を観察するために、タイムコース実験を行うことができます。
  • カバレッジ（深度とも呼ばれる）： RNAはDNAで観察されるものと同じ変異を内包しており、検出にはより深いカバレッジが必要です。十分なカバレッジがあれば、RNA-Seqを用いて各アレルの発現を推定することができます。これにより、インプリンティングやシス制御効果といった現象への洞察が得られる可能性があります。特定のアプリケーションに必要なシーケンシングの深度は、パイロット実験から推定することができます。[37]
  • データ生成アーティファクト（技術的差異とも呼ばれる）：試薬（例：ライブラリー調製キット）、関係者、シーケンサーの種類（例：Illumina、Pacific Biosciences）によって、意味のある結果と誤って解釈される可能性のある技術的アーティファクトが生じる可能性があります。あらゆる科学実験と同様に、RNA-Seqは適切に管理された環境で実施することが賢明です。これが不可能な場合、または研究がメタアナリシスである場合は、潜在変数（通常は主成分分析または因子分析）を推定し、その後これらの変数を修正することで技術的アーティファクトを検出するという別の解決策があります。[38]
  • データ管理：ヒトにおけるRNA-Seq実験1回あたりは通常1～5GB（圧縮時）で、中間ファイルを含めるとそれ以上になります。[39]この膨大なデータはストレージの問題を引き起こす可能性があります。解決策の一つは、多目的計算スキーマ（例：gzip ）またはゲノミクス特有のスキーマを用いてデータを圧縮することです。後者は、参照配列またはde novo配列に基づくことができます。もう一つの解決策は、マイクロアレイ実験を行うことです。これは、仮説に基づく研究や複製研究（探索的研究とは対照的）には十分な場合があります。

分析

トランスクリプトームアセンブリ

標準的なRNA-Seq解析ワークフロー。シーケンスされたリードはリファレンスゲノムおよび／またはトランスクリプトームにアライメントされ、その後、様々な品質管理、発見、仮説に基づく解析のために処理されます。

生のシーケンスリードをゲノム特徴に割り当てる（つまり、トランスクリプトームを組み立てる）には、次の 2 つの方法が使用されます。

  • De novo:このアプローチは、トランスクリプトームを再構築するためにリファレンスゲノムを必要とせず、ゲノムが未知、不完全、またはリファレンスと比較して大幅に変更されている場合に通常使用されます。[40] de novoアセンブリに短いリードを使用する場合の課題には、1)どのリードを連続した配列（コンティグ）に結合するかの決定、2)シーケンスエラーやその他のアーティファクトに対する堅牢性、および3)計算効率が含まれます。de novoアセンブリに使用される主要なアルゴリズムは、リード間のすべてのペアワイズオーバーラップを識別するオーバーラップグラフから、リードを長さkのシーケンスに分割し、すべてのk-merをハッシュテーブルに折りたたむde Bruijnグラフに移行しました。[41]オーバーラップグラフはサンガーシーケンスで使用されていましたが、RNA-Seqで生成される数百万のリードにうまく拡張できませんでした。 de Bruijnグラフを用いるアセンブラの例としては、Trinity [40] 、 Oases [42]（ゲノムアセンブラVelvet [43]から派生）、Bridger [44] 、 rnaSPAdes [45 ] などがある。同一サンプルのペアエンドシーケンシングとロングリードシーケンシングは、テンプレートまたはスケルトンとして機能し、ショートリードシーケンシングの欠点を軽減することができる。de novoアセンブリの品質を評価する指標には、コンティグ長の中央値、コンティグ数、N50などがある。[46]
イントロンが分割されたショートリードを用いたRNA-Seqアライメント。mRNA配列および参照ゲノムに対するショートリードのアライメント。アライメントソフトウェアは、エクソン-エクソンジャンクション（赤で表示）に重なり、pre-mRNAおよび参照ゲノムのイントロン部分をスキップするショートリードを考慮する必要がある。
  • ゲノムガイド:このアプローチは、DNAアライメントに使用されるのと同じ方法に依存していますが、参照ゲノムの非連続部分をカバーするリードをアライメントするという複雑さが加わります。[47]これらの非連続リードは、スプライスされた転写産物の配列決定の結果です（図を参照）。通常、アライメントアルゴリズムには2つのステップがあります。1) リードの短い部分をアライメントする（つまり、ゲノムをシードする）、2)動的プログラミングを使用して最適なアライメントを見つける（場合によっては既知のアノテーションと組み合わせる）です。ゲノムガイドアライメントを使用するソフトウェアツールには、Bowtie、[48] TopHat（BowTieの結果に基づいてスプライスジャンクションをアライメントする）、[49] [50] Subread、[51] STAR、[47] HISAT2、[52] GMAPなどがあります。[53]ゲノムガイドアライメント（マッピング）ツールの出力は、Cufflinks [50]やStringTie [54]などのツールで連続した転写産物配列（すなわちFASTAファイル）を再構築するためにさらに利用することができる。ゲノムガイドアセンブリの品質は、1) de novoアセンブリメトリクス（例：N50）と、2)精度、再現率、またはそれらの組み合わせ（例：F1スコア）を用いた既知の転写産物、スプライスジャンクション、ゲノム、およびタンパク質配列との比較の両方で測定することができる。[46]さらに、シミュレーションリードを用いてin silico評価を行うこともできる。[55] [56]

アセンブリ品質に関する注記：現在のコンセンサスとしては、1) アセンブリ品質は使用する指標によって異なる可能性があること、2) ある種において高いスコアを獲得したアセンブリツールが必ずしも他の種においても高いパフォーマンスを発揮するとは限らないこと、3) 異なるアプローチを組み合わせることが最も信頼できる可能性があること、などが挙げられます。[57] [58] [59]

遺伝子発現の定量化

発現は、外部刺激に対する細胞の変化、健康状態と疾患状態の違い、その他の研究課題を研究するために定量化されます。転写産物レベルはタンパク質存在量の代理指標としてしばしば用いられますが、 RNA干渉やナンセンス変異誘発による分解といった転写後イベントの影響により、必ずしも等価とはならないことがよくあります。[60]

発現は、トランスクリプトームアセンブリステップで各遺伝子座にマッピングされたリード数をカウントすることによって定量化されます。発現は、コンティグまたは参照トランスクリプトアノテーションを使用してエクソンまたは遺伝子に対して定量化できます。[20]これらの観察されたRNA-Seqリード数は、発現マイクロアレイやqPCRなどの古い技術に対して確実に検証されています。[37] [61]カウントを定量化するツールには、HTSeq、[62] FeatureCounts、[63] Rcount、[64] maxcounts、[65] FIXSEQ、[66] Cuffquantがあります。これらのツールは、アライメントされたRNA-Seqデータからリード数を決定しますが、Sailfish [67]およびKallistoを使用してアライメントフリーのカウントを取得することもできます。 [68]次に、リード数は仮説検定、回帰、およびその他の分析に適切な指標に変換されます。この変換のパラメーターは次のとおりです。

  • シーケンス深度/カバレッジ:複数のRNA-Seq実験を実施する場合、深度は事前に指定されますが、それでも実験間で大きく異なります。 [69]そのため、1回の実験で生成されるリードの総数は通常、カウントをフラグメント、リード、またはマップされたリード100万個あたりのカウント (FPM、RPM、またはCPM) に変換することによって正規化されます。RPMとFPMの違いは、歴史的に、フラグメントのシングルエンドシーケンスからペアエンドシーケンスへの進化の間に導き出されました。シングルエンドシーケンスでは、フラグメントごとにリードは1つだけです (つまり、RPM = FPM)。ペアエンドシーケンスでは、フラグメントごとにリードが2つあります (つまり、RPM = 2 x FPM)。シーケンス深度は、実験における中間cDNA分子の数であるライブラリサイズと呼ばれることもあります
  • 遺伝子長：転写産物の発現が同じであれば、長い遺伝子は短い遺伝子よりもフラグメント数／リード数／カウント数が多くなります。これは、FPMを特徴量（遺伝子、転写産物、またはエクソン）の長さで割ることで調整され、結果として、1キロベースあたりのフィーチャーのメトリックフラグメント数／百万マッピングリード数（FPKM）が得られます。[70]サンプル間のフィーチャーグループを調べる場合、FPKMは、各FPKMをサンプル内のFPKMの合計で割ることで、100万あたりの転写産物数（TPM）に変換されます。[71] [72] [73]
  • 総サンプルRNA出力：各サンプルから同量のRNAが抽出されるため、総RNA量が多いサンプルでは遺伝子あたりのRNA量が少なくなります。これらの遺伝子は発現が低下しているように見え、下流の解析で偽陽性の結果につながります。[69]クォンタイル、DESeq2、TMM、中央値比などの正規化戦略は、サンプル間で発現に差がない遺伝子セットを比較し、それに応じてスケーリングすることで、この差異を考慮しようとします。[74]
  • 各遺伝子発現の分散：サンプリング誤差（リード数が少ない遺伝子では重要）を考慮し、検出力を高め、偽陽性を減らすためにモデル化されます。分散は正規分布、ポアソン分布、または負の二項分布として推定することができ[75] [76] [77]、技術的分散と生物学的分散に分解されることがよくあります。

ゲノム全体の効果の絶対定量化と検出のためのスパイクイン

RNA スパイクインは、実験設計や下流の分析でゲノム全体の効果の絶対定量化と検出を行う際のゴールド スタンダードとして使用できる、既知濃度の RNA サンプルです。

  • 絶対定量：遺伝子発現の絶対定量は、ほとんどのRNA-Seq実験では不可能です。これらの実験では、すべての転写産物に対する相対的な発現を定量します。スパイクイン（既知濃度のRNAサンプル）を用いてRNA-Seqを実行することで、これが可能になります。シーケンス後、スパイクイン配列のリードカウントを用いて、各遺伝子のリードカウントと生物学的断片の絶対量との関係を決定します。[17] [78]一例として、この技術はアフリカツメガエル（Xenopus tropicalis）の胚において転写速度論を決定するために使用されました。 [79]
  • ゲノムワイド効果の検出：クロマチンリモデラー、転写因子（MYCなど）、アセチルトランスフェラーゼ複合体、ヌクレオソームの位置などのゲノムワイド調節因子の変化は正規化の仮定と一致しないため、スパイクインコントロールによって正確な解釈が可能となる。[80] [81]

差次的発現

RNA-Seqの最も単純でありながら、しばしば最も強力な用途は、2つ以上の条件（例えば、処理済みと未処理）間の遺伝子発現の差を見つけることであり、このプロセスは差次的発現と呼ばれています。出力はしばしば差次的発現遺伝子（DEG）と呼ばれ、これらの遺伝子はアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション（すなわち、対象の条件で高いか低いか）のいずれかになります。差次的発現を実行するツールは多数あります。そのほとんどはR、Python、またはUnixコマンドラインで実行されます。一般的に使用されるツールにはDESeq、 [76] edgeR、[77] voom+limma [75] [82]があり、これらはすべてR/ Bioconductor [83]から入手できます。[ 84]差次的発現を実行する際の一般的な考慮事項は次のとおりです。

  • 入力:差次的発現の入力には、(1) RNA-Seq発現マトリックス (M遺伝子 x Nサンプル) と (2) Nサンプルの実験条件を含む設計マトリックスが含まれます。最も単純な設計マトリックスには、テストされている条件のラベルに対応する1つの列が含まれます。その他の共変量 (因子、特徴、ラベル、またはパラメーターとも呼ばれる) には、バッチ効果、既知のアーティファクト、遺伝子発現を交絡または媒介する可能性のあるメタデータが含まれます。既知の共変量に加えて、主成分分析、代理変数分析、[85]およびPEER分析[38]などの教師なし機械学習アプローチを使用して、未知の共変量を推定することもできます。隠れた変数分析は、メタデータで捕捉されていない追加のアーティファクト (例: 虚血時間、複数の機関からの調達、根本的な臨床形質、多くの人員による長年にわたるデータ収集) を持つことが多いヒト組織のRNA-Seqデータによく使用されます。
  • 方法:ほとんどのツールは、回帰またはノンパラメトリック統計を使用して、発現差のある遺伝子を識別しており、参照ゲノムにマッピングされたリード数（DESeq2、limma、edgeR）またはアライメントフリー定量化から得られたリード数（sleuth、[86] Cuffdiff、[87] Ballgown [88]）に基づいています。[89]回帰の後、ほとんどのツールは、複数の仮説（ヒト研究では、約20,000個のタンパク質コード遺伝子または約50,000個のバイオタイプ）を考慮するために、ファミリーワイズエラー率（FWER）または偽発見率（FDR）のp値調整を採用しています。
  • 出力：典型的な出力は、遺伝子の数に対応する行と、少なくとも3つの列（各遺伝子のlog倍数変化（条件間の発現比のlog変換、効果サイズの尺度）、p値、および多重比較調整p値）で構成されます。遺伝子は、効果サイズ（log 倍数変化）と統計的有意性のカットオフを満たした場合、生物学的に意味があると定義されます。これらのカットオフは理想的には事前に指定する必要がありますが、RNA-Seq実験の性質上、探索的なものであることが多いため、効果サイズと適切なカットオフを事前に予測することは困難です。
  • 落とし穴:これらの複雑な方法の存在意義は、統計的エラーや誤解を招く解釈につながる可能性のある無数の落とし穴を回避することです。落とし穴には、偽陽性率の増加（多重比較による）、サンプル準備のアーティファクト、サンプルの異質性（混合遺伝的背景など）、相関の高いサンプル、考慮されていない多段階実験デザイン、不適切な実験デザインなどがあります。注目すべき落とし穴の1つは、遺伝子名がテキストのままであることを保証するためにインポート機能を使用せずにMicrosoft Excelで結果を表示することです。[90] Excelは便利ですが、一部の遺伝子名（ SEPT1、DEC1、MARCH2）を日付または浮動小数点数に自動的に変換します。
  • ツールの選択とベンチマーク：これらのツールの結果を比較する取り組みは数多く行われており、DESeq2は他の方法よりもやや優れている傾向があります。[91] [ 92] [93] [94] [ 28] [89] [95] [96]他の方法と同様に、ベンチマークはツールの出力を互いに比較し、既知のゴールドスタンダードと比較することで構成されます。

差次的発現遺伝子リストの下流解析には、観察の検証と生物学的推論の2種類があります。差次的発現とRNA-Seqの落とし穴のため、重要な観察は、(1)同じサンプルでの直交法（リアルタイムPCRなど）または(2)新しいコホートでの別の（場合によっては事前登録された）実験で再現されます。後者は一般化の可能性を保証するのに役立ち、通常はプールされたすべてのコホートのメタ解析で追跡できます。結果のより高度な生物学的理解を得るための最も一般的な方法は遺伝子セットエンリッチメント解析ですが、候補遺伝子アプローチが使用されることもあります。遺伝子セットエンリッチメントは、2つの遺伝子セット間の重複が統計的に有意かどうかを判定します。この場合、差次的発現遺伝子と、既知のパスウェイ/データベース（遺伝子オントロジー、KEGG、ヒト表現型オントロジーなど）からの遺伝子セット、または同じデータ（共発現ネットワークなど）での補完的な解析からの遺伝子セットとの重複です。遺伝子セットエンリッチメントに用いられる一般的なツールには、ウェブインターフェース（例：ENRICHR、g:profiler、WEBGESTALT）[97]やソフトウェアパッケージなどがあります。エンリッチメントの結果を評価する際の一つのヒューリスティックは、まず既知の生物学的特性のエンリッチメントを健全性チェックとして調べ、その後、新たな生物学的特性の探索へと範囲を拡大することです。

選択的RNAスプライシングモードの例。エクソンは青と黄色のブロックで、スプライスされたイントロンは2つのエクソンを結ぶ黒い水平線で、エクソン間ジャンクションは2つのエクソンを結ぶ細い灰色の線で表されます。

選択的スプライシング

RNAスプライシングは真核生物にとって不可欠であり、タンパク質の調節と多様性に大きく貢献しており、ヒト遺伝子の90%以上で発生しています。[98]選択的スプライシングには複数のモードがあります。エクソンスキッピング（ヒトおよび高等真核生物で最も一般的なスプライシングモード）、相互排他的エクソン、選択的ドナーまたはアクセプター部位、イントロン保持（植物、真菌、原生生物で最も一般的なスプライシングモード）、選択的転写開始部位（プロモーター）、および選択的ポリアデニル化です。[98] RNA-Seqの目的の一つは、選択的スプライシングイベントを特定し、それらが条件間で異なるかどうかをテストすることです。ロングリードシーケンシングは完全な転写産物を捕捉するため、曖昧なリードマッピングなど、アイソフォームの量を推定する際の多くの問題を最小限に抑えることができます。ショートリードRNA-Seqでは、選択的スプライシングを検出する複数の方法があり、それらは主に3つのグループに分類できます。[99] [71] [100]

  • カウントベース（イベントベース、差動スプライシングとも）：エクソン保持を推定する。例としては、DEXSeq、[101]、MATS、[102]、SeqGSEA [103]などがある。
  • アイソフォームベース（マルチリードモジュール、差次的アイソフォーム発現も含む）：まずアイソフォームの存在量を推定し、次に条件間の相対的な存在量を推定する。例としては、Cufflinks 2 [104]やDiffSplice [105]などがある。
  • イントロン除去に基づく：スプリットリードを用いて選択的スプライシングを計算する。例としてはMAJIQ [106]やLeafcutter [100]などがある。

RSEMなどの他のツールで事前にアイソフォームを定量化しておけば、遺伝子発現差ツールをアイソフォーム発現差にも使用できる。[107]

共発現ネットワーク

共発現ネットワークは、組織や実験条件を超えて同じように動作する遺伝子のデータ由来の表現である。[108]その主な目的は、これまで未知であった遺伝子の機能を推測するための仮説生成とギルト・バイ・アソシエーション・アプローチにある。[108] RNA-Seqデータは、植物[109]と哺乳類[110]の両方で、ピアソン相関に基づいて特定のパスウェイに関与する遺伝子を推測するために使用されている。[110]この種の分析におけるマイクロアレイプラットフォームに対するRNA-Seqデータの主な利点は、トランスクリプトーム全体をカバーできるため、遺伝子制御ネットワークのより完全な表現を解明できる可能性があることである。同じ遺伝子のスプライスアイソフォームの差動制御を検出し、それらの生物学的機能を予測するために使用することができる。[111] [112]加重遺伝子共発現ネットワーク解析は、 RNA seqデータに基づいて共発現モジュールとモジュール内ハブ遺伝子を特定するために効果的に使用されてきた。共発現モジュールは、細胞の種類や経路に対応する場合があります。高度に接続されたモジュール内ハブは、それぞれのモジュールを代表するものとして解釈できます。固有遺伝子とは、モジュール内のすべての遺伝子の発現量の加重和です。固有遺伝子は、診断と予後予測に有用なバイオマーカー（特徴）です。[113] RNAシーケンスデータに基づいて相関係数を推定するための分散安定化変換アプローチが提案されています。[109]

変異体の発見

RNA-Seqは、一塩基変異、小さな挿入／欠失、構造変異などのDNA変異を捕捉します。RNA -Seqにおける変異呼び出しはDNA変異呼び出しと似ており、多くの場合、スプライシングを考慮した調整を加えた同じツール（SAMtools mpileup [114]やGATK HaplotypeCaller [115]など）が使用されます。RNA変異のユニークな特徴の1つは、対立遺伝子特異的発現（ASE）です。これは、インプリンティングや発現量的形質遺伝子座、非コード性の稀少変異などの調節効果により、1つのハプロタイプのみの変異が優先的に発現される可能性があることを意味します。[116] [117] RNA変異体同定の限界としては、発現した領域（ヒトではゲノムの5%未満）のみを反映すること、データ処理によってバイアスが生じる可能性があること（例えば、de novoトランスクリプトームアセンブリではヘテロ接合性が過小評価される[118]）、直接DNA配列決定に比べて品質が低いことなどが挙げられます。

RNA編集（転写後変化）

個体のゲノム配列とトランスクリプトーム配列が一致すると、転写後編集（RNA編集）の検出に役立ちます。[3]遺伝子の転写産物にゲノムデータでは観察されない対立遺伝子/変異体がある場合、転写後修飾イベントが特定されます。

遺伝子融合イベントと、遺伝子融合の両側に位置するペアエンドリードの挙動。遺伝子融合は、トランス（別々の染色体上の遺伝子間）またはシス（同一染色体上の2つの遺伝子間）で発生する可能性があります。

融合遺伝子検出

ゲノム中の異なる構造変化によって引き起こされる融合遺伝子は、癌との関連性から注目を集めています。[119] RNA-Seqはサンプルのトランスクリプトーム全体を偏りなく解析できるため、癌におけるこのような一般的なイベントを見つけるための魅力的なツールとなっています。[4]

このアイデアは、短いトランスクリプトームリードを参照ゲノムにアライメントするプロセスから派生したものです。ほとんどの短いリードは 1 つの完全なエクソン内に収まり、より小さいながらも大きなセットは既知のエクソン間ジャンクションにマッピングされると予想されます。残りのマッピングされていない短いリードは、エクソンが異なる遺伝子に由来するエクソン間ジャンクションに一致するかどうかを判断するためにさらに分析されます。これは融合イベントの可能性を示す証拠となりますが、リードが長いため、非常にノイズが多くなる可能性があります。別のアプローチとして、ペアエンドリードを使用することがあります。この方法では、多数のペアエンドリードがそれぞれの末端を異なるエクソンにマッピングする可能性があるため、これらのイベントをより適切にカバーできます (図を参照)。それでもなお、最終結果は複数の、場合によっては新しい遺伝子の組み合わせで構成され、さらなる検証のための理想的な出発点となります。

コピー数解析

コピー数解析（CNA）はがん研究で広く用いられています。遺伝子の増減はシグナル伝達経路に影響を与え、腫瘍学における分子機能不全の重要なバイオマーカーです。RNA-SeqデータからCNA情報を取得することは、遺伝子発現の違いにより遺伝子間で異なる大きさのリード深度のばらつきが生じるため、容易ではありません。これらの困難さから、これらの解析のほとんどは通常、全ゲノムシーケンシング／全エクソームシーケンシング（WGS/WES）を用いて行われます。しかし、高度なバイオインフォマティクスツールはRNA-SeqからCNA情報を取得することができます。[9]

バイオマーカーの発見

RNA-Seqは、新たな疾患生物学の特定、臨床適応症のバイオマーカーのプロファイリング、創薬可能な経路の推測、そして遺伝子診断を行う可能性を秘めています。[120] [121]これらの結果は、サブグループや個々の患者に合わせてさらに個別化することができ、より効果的な予防、診断、そして治療法の発見につながる可能性があります。このアプローチの実現可能性は、費用と時間というコストによって部分的に左右されます。また、この解析によって生成される膨大な量のデータを完全に解釈するためには、専門家チーム（バイオインフォマティクス専門家、医師／臨床医、基礎研究者、技術者）が必要となるという制約もあります。[122]

マルチオミクス

ENCODE（DNA要素百科事典）プロジェクトとTCGA（がんゲノムアトラス）プロジェクトがRNA-Seqデータを使用してそれぞれ数十の細胞株[123]と数千の原発性腫瘍サンプル[124]を特徴付けて以来、 RNA-Seqデータは大きな重要性を増している。ENCODEは、さまざまな細胞株コホートのゲノムワイドな調節領域を特定することを目的としており、トランスクリプトミクスデータは、これらのエピジェネティックおよび遺伝子調節層の下流効果を理解するために最も重要である。一方、TCGAは、悪性転換と進行の根本的メカニズムを理解するために、30種類の腫瘍から数千の患者サンプルを収集して分析することを目的としていた。この文脈では、RNA-Seqデータは、疾患のトランスクリプトミクス状態の独自のスナップショットを提供し、さまざまな技術では検出されない可能性のある新しい転写産物、融合転写産物、および非コードRNAの識別を​​可能にする、偏りのない転写産物の集団を調べることができる。

その他の新たな分析とアプリケーション

RNA-Seqの応用は日々拡大しています。RNA-Seqの他の新しい応用としては、微生物汚染の検出[125] 、細胞タイプの存在量の決定（細胞タイプデコンボリューション）[9] 、 TEの発現測定、ネオアンチゲンの予測などが挙げられます[9]。

参照

参考文献

この記事は2019年にWikiJournal of Scienceに外部学術査読（査読者レポート）のために提出されました。更新されたコンテンツは、CC-BY-SA-3.0ライセンス（ 2021年）に基づきWikipediaページに再統合されました。査読済み版は、 Felix Richter他 (2021年5月17日). "A broad introduction to RNA-Seq" (PDF) . WikiJournal of Science . 4 (2): 4. doi : 10.15347/WJS/2021.004 . ISSN  2470-6345. Wikidata  Q100146647.

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  124. ^ 「The Cancer Genome Atlas – Data Portal」。2011年10月15日時点のオリジナルよりアーカイブ。2013年7月28日閲覧。
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さらに読む

  • 田口雄一 (2019). 「比較トランスクリプトミクス解析」.バイオインフォマティクスと計算生物学百科事典. pp.  814– 818. doi :10.1016/B978-0-12-809633-8.20163-5. ISBN 978-0-12-811432-2. S2CID  65302519。
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Scholia にはRNA-Seqのトピックプロファイルがあります。
  • Cresko B, Voelker R, Small C (2001). Bassham S, Catchen J (編). 「RNAセクロペディア」. オレゴン大学.: RNA-Seq 実験の設計と実装に関する高レベルのガイド。