クライオ電子顕微鏡
Electron microscopy technique
リーズ大学のTitan Krios

極低温電子顕微鏡法（クライオEM）は、極低温に冷却された試料に適用される透過型電子顕微鏡法である。生物試料の場合、試料の構造はガラス質氷の環境に包埋することで保存される。試料水溶液をグリッドメッシュに塗布し、液体エタンまたは液体エタンとプロパンの混合液中で凍結させる。[1]この技術の開発は1970年代に始まったが、近年の検出器技術とソフトウェアアルゴリズムの進歩により、生体分子の構造を原子レベルに近い分解能で決定することが可能になった。[2]これにより、構造生物学分野において、X線結晶構造解析やNMR分光法の代替として、この手法は広く注目を集めている。 [3]

2017年、ノーベル化学賞はジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンに授与されました。受賞理由は「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡法の開発」でした。[4]また、 Nature Methods誌は2015年にクライオ電子顕微鏡を「今年の手法」に選出しました。[5]

歴史

初期の開発

1960年代には、高エネルギー電子線による放射線損傷のため、生物試料の構造決定における透過型電子顕微鏡の使用は限られていました。科学者たちは、低温で試料を検査することでビーム誘起の放射線損傷を軽減できると仮説を立てました。 [6]液体ヘリウム（-269  ℃または 4Kまたは-452.2  ℉）と液体窒素（-195.79℃または77Kまたは-320℉）はどちらも極低温物質として考えられていましたが、 [7]高い安定性は達成されませんでした。1980年、Erwin KnapekとJacques Dubochetは、極低温におけるビーム損傷に関するコメントを発表し、次のような観察結果を共有しました。

炭素膜上にマウントされた薄い結晶は、室温よりも4Kで30～300倍ビーム耐性が高いことがわかりました…私たちの結果のほとんどは、4K領域での凍結保護が温度に強く依存していると仮定することで説明できます。[8]

しかし、これらの結果は再現性がなく、わずか2年後に修正版[9]が発表され、Nature誌の解説[10]では、ビーム耐性は当初予想されていたよりも重要ではなかったことが示されました。4Kで得られた保護は、以前に述べられていたよりも「L-バリンの標準サンプルの10倍」に近いものでした。[10]クライオ電子顕微鏡のサンプルは通常、液体窒素温度で収集されますが、[11]サンプルの挙動を理解し、液体ヘリウム温度で収集するための研究が継続されています。[12] [13] [11]

1981年、欧州分子生物学研究所の科学者アラスデア・マクドウォールとジャック・デュボシェが、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）の初めての導入に成功したと報告した。[14]マクドウォールとデュボシェは、親水性カーボンフィルムに純水を噴霧し、急速に極低温（77 Kに冷却した液体プロパンまたは液体エタン）に浸すことで、薄膜状に純水をガラス化した。非晶質氷の薄い層の厚さは1 μm未満で、電子回折パターンにより非晶質/ガラス質氷の存在が確認された。1984年、デュボシェのグループは、ガラス化したアデノウイルス2型、T4バクテリオファージ、セムリキ森林ウイルス、バクテリオファージCbK、水疱性口内炎ウイルスの分析を行い、構造生物学におけるクライオ電子顕微鏡の威力を実証した。[15]この論文は一般的にクライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）の起源を示すものと考えられており、この技術は世界中の多くの研究室で日常的に使用されるまでに発展しました。

イメージングに使用される電子のエネルギー（80～300 kV）は、有機および生物学的サンプルの共有結合を切断する可能性があります。 [16]このような標本をイメージングする場合、画像を取得するために使用される電子の露出を制限する必要があります。この低い露出では、専用のソフトウェアを使用して、数千、あるいは数百万の同一の凍結分子の画像を選択、整列、平均化し、高解像度のマップを取得する必要があります。2012年には、直接電子検出器とより優れた計算アルゴリズムの導入により、構造的特徴の大幅な改善が達成されました。[17]

最近の進歩

電子検出器技術、特に直接電子検出器の進歩と、より強力なソフトウェア画像化アルゴリズムにより、原子に近い解像度で高分子の構造を決定できるようになりました。 [18]画像化された高分子には、ウイルス、リボソーム、ミトコンドリア、イオンチャネル、酵素複合体などがあります。2018年から、クライオ電子顕微鏡はヘモグロビン（64 kDa）[19]のような小さな構造にも適用でき、解像度は最大1.8 Å [20]です。 2019年には、クライオ電子顕微鏡構造はタンパク質データバンクに登録された構造の2.5%を占め、[21]この数は増え続けています。[22]クライオ電子顕微鏡の応用例として、傾斜した2D画像からサンプルの3D再構成を行うクライオ電子トモグラフィー（クライオET）があります。

2010年代は電子カメラの劇的な進歩が顕著でした。特に、直接電子検出器の改良は「解像度革命」[23]をもたらし、アミノ酸の位置と配向を解明するための重要な約2～3Åの限界を下回る解像度の壁を押し上げました。[24]

ヘンダーソン氏（MRC分子生物学研究所、英国ケンブリッジ）は、ラザフォード・アップルトン研究所のエンジニアおよびマックス・プランク協会の科学者とコンソーシアムを結成し、最初のプロトタイプの資金提供と開発を行いました。その後、コンソーシアムは電子顕微鏡メーカーのFEIと提携し、新しい設計の展開と販売を行いました。ほぼ同時期に、カリフォルニア州プレザントンのGatan社は、ピーター・デネス氏（ローレンス・バークレー国立研究所）とデビッド・アガード氏（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）によって設計された同様の検出器を発表しました。3つ目のタイプのカメラは、ダイレクト・エレクトロン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のグエン・フー・シュオン氏によって開発されました。[23]

最近では、タンパク質ベースのイメージングスキャフォールドの使用における進歩が、サンプルの配向バイアスとサイズ制限の問題の解決に役立っています。クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）の最小サイズは未だ決定されていませんが、約50kDa未満のタンパク質は一般的に信号対雑音比（SNR）が低すぎるため、画像内のタンパク質粒子を分離することができず、3D再構成が困難または不可能になります。[25] [26]小さなタンパク質の構造を決定する際にSNRを向上させる複数の技術が報告されています。[27] [28]高親和性DARPin、ナノボディ、抗体フラグメント[29]に基づくこれらの方法は、標的タンパク質を強固に結合し、それによって有効粒子サイズを増加させ、対称性を導入することで、クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）マップ再構成のSNRを向上させます。

2017年ノーベル化学賞

クライオ電子顕微鏡が生化学に与えた影響が認められ、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3人の科学者が、 「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡法の開発」によりノーベル化学賞を受賞しました。 [4]

X線結晶構造解析との比較

伝統的に、X線結晶構造解析は生体分子の3D構造を決定するための最も一般的な手法でした。[30]しかし、前述のクライオ電子顕微鏡の改良により、生体分子の詳細を調べるためのツールとしての人気が高まっています。2010年以降、クライオ電子顕微鏡による年間構造の登録数はX線結晶構造解析を上回っています。[31] X線結晶構造解析は数十年にわたる長い歴史のため、登録数が大幅に多いものの、2つの手法の総登録数は2035年頃に上回ると予測されています。[31]

X線結晶構造解析の解像度は結晶の均一性によって制限されます[32]。また、理想的な結晶化条件が不明な生物学的分子を結晶状態に誘導するには非常に時間がかかり、極端な場合には数か月、あるいは数年かかることもあります[33] 。対照的に、クライオ電子顕微鏡（クライオEM）における試料調製では、タンパク質の凝集や優先配向などの問題を克服するために、複数回のスクリーニングと最適化が必要になる場合があります[34] [35]。しかし、試料が結晶を形成する必要はなく、クライオ電子顕微鏡用の試料は急速凍結され、ほぼ天然の状態で検査されます[36]

Proteopediaによると、タンパク質データバンクにおけるX線結晶構造解析による平均分解能（2019年5月19日現在）は2.05Å [32]であり、記録上最高の分解能（2022年9月30日現在）は0.48Å [37]です。2020年現在、クライオ電子顕微鏡（クライオEM）によって決定されたタンパク質構造の大部分は、3～4Å [38]という低い分解能です。 しかし、2020年現在、最高のクライオ電子顕微鏡（クライオEM）分解能は1.22Å [35]と記録されており、場合によっては分解能の点で競合する可能性があります。

生物試料

薄膜

生物学的試料は電子顕微鏡グリッド上に広げられ、通常は液体窒素温度に近い液体エタン中で急速凍結により凍結水和状態で保存されます。標本を液体窒素温度またはそれ以下に維持することで、電子顕微鏡カラムの高真空に導入することができます。ほとんどの生物学的標本は放射線感受性が非常に高いため、低線量技術で画像化する必要があります（透過型電子顕微鏡の低温は、放射線損傷に対する追加の保護因子として役立ちます）。

その結果、画像には非常にノイズが多くなります。一部の生物系では、単粒子解析と呼ばれる手法を用いて画像を平均化することで信号対雑音比を高め、標本に関する高解像度の情報を取得することが可能です。このアプローチでは、一般的に平均化されるものが同一である必要がありますが、現在では限られた立体構造の不均一性（リボソームなど）を研究できるようになりました。タンパク質複合体やウイルスのクライオTEM像からの3次元再構成は、サブナノメートルまたは原子レベルに近い解像度で解読されており、これらの大規模集合体の構造と生物学に関する新たな知見が得られています。

膜貫通タンパク質の2次元結晶やタンパク質のらせん状配列など、タンパク質の秩序だった配列の解析でも、標本に関する高解像度の情報を提供できる一種の平均化が可能になります。この手法は電子結晶構造解析と呼ばれています。

硝子体切片

薄膜法は、電子が多重散乱なしに厚い試料を通過できないため、薄い試料（通常500nm未満）に限定されます。厚い試料は、エタン中でプランジ凍結（クライオフィクセーション）（厚さ最大数十μm）するか、より一般的には高圧凍結（厚さ最大数百μm）によってガラス化できます。その後、クライオウルトラミクロトームでダイヤモンドナイフを用いて、-135 ℃（失透温度）未満の温度で薄切片（厚さ40～200nm）に切断することができます。切片は電子顕微鏡グリッド上に収集され、薄膜でガラス化された試料と同じ方法で画像化されます。この技術は、ガラス体切片の透過型電子クライオ顕微鏡法（CEMOVIS）または凍結水和切片の透過型電子クライオ顕微鏡法と呼ばれます。

材料試料

クライオTEMは、ガラス化された生物試料の観察を可能にするだけでなく、真空中では揮発性が高すぎて標準的な室温電子顕微鏡では観察できない材料試料の観察にも使用できます。例えば、液体と固体の界面のガラス化された切片をクライオTEMで分析するために抽出することができ、[39]、電子顕微鏡の真空中で昇華しやすい硫黄をクライオTEMで安定化させ、観察することができます。[40]

クライオTEMにおける画像処理

電子顕微鏡法におけるほとんどのアプローチでは、物質の最高解像度の画像を取得しようとしますが、クライオTEMでは必ずしもそうではありません。高解像度画像の利点はありますが、信号対雑音比は依然として、各粒子の配向を割り当てることを妨げる主な障害となっています。例えば、高分子複合体では、画像化中に3Dから2Dに投影される複数の異なる構造があり、それらを区別しないと画像処理の結果はぼやけてしまいます。そのため、この種の研究では確率的アプローチがより強力になります。[41]クライオEM画像処理で現在広く使用されている2つの一般的なアプローチがあります。1998年に発見された最大尤度アプローチ[42]と、比較的最近採用されたベイズアプローチです。[43]

最尤推定法は統計学からこの分野に持ち込まれました。この方法では、粒子のあらゆる可能な方向を合計して、結果として得られる確率分布を得ます。これは、画像ごとに粒子が正確な方向を持つ典型的な最小二乗推定法に似ています。[44]この方法では、サンプル内の粒子は計算後に「あいまいな」方向を持ち、対応する確率によって重み付けされます。このプロセス全体は反復的であり、反復するたびにモデルは改善されます。実際の構造をよりよく表すモデルを作成するための良好な条件は、データに過度のノイズがなく、粒子に特定の方向がないことです。最尤推定法の主な欠点は、結果が初期推定値に依存し、モデルの最適化が局所的最小値で行き詰まってしまう場合があることです。[45]

現在クライオTEMで使用されているベイズ的アプローチは、本質的に経験的です。つまり、粒子の分布は元のデータセットに基づいています。同様に、通常のベイズ法では、データの観測後に変更される固定の事前確率があります。最尤推定との主な違いは、結果のマップを滑らかにするのに役立つ特別な再構成項にあり、再構成中のノイズも低減します。[44]マップの平滑化は、事前確率をガウス分布と仮定し、フーリエ空間でデータを分析することによって行われます。事前知識とデータセット間の接続が確立されているため、人的要因によるエラーの可能性が低くなり、画像再構成の客観性が向上する可能性があります。[43]

クライオTEMイメージングと画像再構成の新しい手法が登場するにつれ、プロセスの自動化に役立つ新しいソフトウェアソリューションが登場しています。経験的ベイズアプローチが3D再構成用のオープンソースコンピュータプログラムRELION（REgularized LIkelihood OptimizatioN）[46] [47]に実装された後、このプログラムはクライオTEM分野で広く普及しました。再構成画像の解像度を向上させるさまざまな補正機能を提供し、Python言語を使用した汎用スクリプトの実装を可能にし、2D/3Dモデル分類やde novoモデル作成などの通常のタスクを実行します。[48] [49]

技術

クライオTEMではさまざまな技術を使用できます。[50]一般的な技術には以下が含まれます。

  1. 単粒子分析（SPA）
    1. 時間分解クライオTEM [51] [52] [53]
  2. 電子クライオトモグラフィー（クライオET）
  3. 電子結晶構造解析
    1. 二次元結晶の解析
    2. らせん状のフィラメントまたはチューブの解析
    3. 微結晶電子回折（MicroED）[54] [55] [56] [57]

相関光クライオTEMとクライオET

2019年には、相関光クライオTEMとクライオETを用いて、神経細胞内のトンネルナノチューブ（TNT）を観察しました。 [58]

走査型電子顕微鏡

走査型電子顕微鏡（クライオSEM）は、走査型電子顕微鏡の冷却ステージを極低温チャンバー内に設置した 走査型電子顕微鏡法です。

極低温透過型電子顕微鏡

極低温透過型電子顕微鏡（クライオTEM）は、構造生物学および材料科学で使用される透過型電子顕微鏡技術です。口語的には、「クライオ電子顕微鏡」またはその短縮形である「クライオEM」という用語は、基本的に極低温透過型電子顕微鏡を指します。これは、クライオEMの大部分が走査型電子顕微鏡ではなく透過型電子顕微鏡で行われるためです。

単粒子分析ワークフロー

高度な手法

参照

ウィキブックスには、分子顕微鏡法のためのソフトウェアツールに関する書籍があります。

参考文献

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