分子生物学において、アラニンスキャンは、特定の残基が特定のタンパク質の安定性や機能にどのように寄与しているかを調べるために用いられる部位特異的変異誘発技術です。 [1] アラニンは、その嵩高くなく化学的に不活性なメチル官能基が、他の多くのアミノ酸が有する二次構造の好みを模倣するために用いられます。変異残基のサイズを維持する必要がある場合には、 バリンやロイシンなどの嵩高いアミノ酸が用いられることもあります。
この技術は、特定の残基の側鎖が生物活性において重要な役割を果たしているかどうかを決定するためにも使用できます。これは通常、部位特異的変異誘発法、またはPCRライブラリーの作成によるランダム変異によって行われます。さらに、理論的なアラニン置換に基づいて熱力学的パラメータを推定する計算手法も開発されています。
この技術は、多くの側鎖を同時に分析できるため、タンパク質の精製や生物物理学的分析が不要であり、迅速です。[2]この技術は現在非常に成熟しており、生化学分野で広く利用されています。得られたデータは、 IR、NMR分光法、数学的手法、生物学的アッセイなどによって検証できます。[3] [4] [5]
アラニンスキャンの良い例としては、タンパク質表面の荷電残基の役割を調べることが挙げられます。[6]上皮性ナトリウムチャネル（ ENaC ）表面の保存された荷電残基の役割に関する体系的な研究では、アラニンスキャンを用いて、タンパク質を細胞表面に輸送するプロセスにおける荷電残基の重要性を明らかにしました。[6]
アプリケーション
アラニンスキャンを用いて、ヒト成長ホルモンとその受容体の細胞外ドメインとの界面に埋もれた19個の側鎖の機能的寄与を同時に決定した。[2]側鎖の各アミノ酸はアラニンに置換された。次に、アラニンスキャン変異誘発と二項式変異誘発の概念をファージディスプレイ技術と組み合わせたショットガンスキャン法が用いられた。
アラニンスキャンのもう一つの重要な応用は、原型シクロチド・カラタB1における個々の残基の構造と活性への影響を明らかにすることである[3] 。シクロチドは薬理学的に重要な幅広い生理活性を示すが、その天然の機能は殺虫剤として植物防御にある。シクロチド・カラタB1の構造において、システイン以外の23残基すべてをアラニンに順次置換した。データはNMR分光法によって検証された。
さらに、アラニンスキャンは、Cry4Aaのどの機能モチーフが殺蚊活性を有するかを決定するためにも用いられます。[4] Cry4Aaはバチルス・チューリンゲンシスによって産生されます。これは双翅目特異的毒素であり、蚊を駆除するための生物殺虫剤の生産において重要な役割を果たします。したがって、Cry4Aaのどの機能モチーフがこの活性に寄与するかを決定することは非常に重要です。本研究では、ドメインIIの受容体結合部位となる可能性のある残基、ループ1、2、および3をアラニンに置換することにより、複数のCry4Aa変異体を作製しました。これらの活性を試験するために、イエカを用いた生物学的検定が行われました。
アラニンワールドモデル
アラニンスキャン法は、点突然変異によってほとんどの標準アミノ酸がアラニンに置換可能であるという事実を利用します。アラニンは、コードされているアミノ酸、あるいは標準アミノ酸の大部分の二次構造の好みを模倣するため、変異タンパク質の二次構造はそのまま残ります。これはアラニンワールドモデルによって予測されます。
参考文献
- ^ Morrison KL, Weiss GA (2001年6月). 「コンビナトリアルアラニンスキャンニング」. Curr Opin Chem Biol . 5 (3): 302–7 . doi :10.1016/S1367-5931(00)00206-4. PMID 11479122.
- ^ ab Weiss GA, Watanabe CK, Zhong A, Goddard A, Sidhu SS (2000年8月). 「コンビナトリアルアラニンスキャンによるタンパク質機能エピトープの迅速マッピング」Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 97 (16): 8950–4 . Bibcode :2000PNAS...97.8950W. doi : 10.1073/pnas.160252097 . PMC 16802. PMID 10908667 .
- ^ ab Simonsen SM, Sando L, Rosengren KJ, Wang CK, Colgrave ML, Daly NL, Craik DJ (2008年4月). 「原型シクロチドのアラニンスキャン変異誘発により、生体活性に必須な残基群が明らかになった」. J. Biol. Chem . 283 (15): 9805–13 . doi : 10.1074/jbc.M709303200 . PMID 18258598.
- ^ ab Howlader MT, Kagawa Y, Miyakawa A, Yamamoto A, Taniguchi T, Hayakawa T, Sakai H (2010年2月). 「Bacillus thuringiensisの蚊駆除毒素Cry4AaのドメインIIにおける3つの主要ループのアラニンスキャン解析」. Appl. Environ. Microbiol . 76 (3): 860–5 . Bibcode :2010ApEnM..76..860H. doi :10.1128/AEM.02175-09. PMC 2813026. PMID 19948851 .
- ^ Gauguin L, Delaine C, Alvino CL, McNeil KA, Wallace JC, Forbes BE, De Meyts P (2008年7月). 「インスリン様成長因子Iの推定受容体結合表面のアラニンスキャン」. J. Biol. Chem . 283 (30): 20821–9 . doi : 10.1074/jbc.M802620200 . PMC 3258947. PMID 18502759 .
- ^ ab Edelheit O, Hanukoglu I, Dascal N, Hanukoglu A (2011年4月). 「アラニン変異誘発による上皮性ナトリウムチャネル（ENaC）サブユニットの細胞外ドメインにおける保存された荷電残基の役割の同定」Am. J. Physiol. Renal Physiol . 300 (4): F887–97. doi :10.1152/ajprenal.00648.2010. PMID 21209000. S2CID 869654.
さらに読む
- Michels CA (2002).生物学研究のための遺伝学的手法：ケーススタディ的アプローチ. ロンドン: J. Wiley. p. 111. ISBN 978-0-471-89921-1。
