硫酸アンモニウム沈殿法は、大規模および実験室規模のタンパク質精製および分画に最も一般的に使用される方法の1つであり、高塩濃度の存在下で タンパク質の溶解度を変化させることでタンパク質を分離するために使用できます。
特性
硫酸アンモニウムは、水溶液中でアンモニウム（ NH+
4）と硫酸塩（SO2-
4）水溶液中で。[1] 硫酸アンモニウムは、溶解性が高く、タンパク質構造を安定化し、密度が比較的低く、入手しやすく、比較的安価であるため、沈殿剤として特に有用です。
メカニズム
硫酸アンモニウムは、他の中性塩と同様に、優先的な溶媒和によってタンパク質を安定化します。タンパク質は通常、細菌の増殖を阻害するため、硫酸アンモニウム中に保存されます。硫酸アンモニウムを添加することで、変性剤によって変性したタンパク質を本来の立体構造に戻すことができます。これは、組換えタンパク質のフォールディングで確認できます。[2]
タンパク質の溶解度は溶液のイオン強度、つまり塩濃度によって変化します。イオン濃度が低い場合（0.5 mol/L未満）、タンパク質の溶解度は塩濃度の上昇とともに増加し、「塩析」と呼ばれる効果が現れます。塩濃度がさらに高くなると、タンパク質の溶解度は低下し始めます。イオン強度が十分に高くなると、タンパク質は溶液から沈殿し、「塩析」と呼ばれる効果が現れます。[3]アンモニウム（NH+
4）と硫酸塩（SO2-
4水溶液中に存在するイオンは、精製対象となる化合物に現れる反対電荷に引き寄せられます。この反対電荷の引き寄せにより、水分子は精製対象となる化合物と相互作用することができず、沈殿、すなわち「塩析」が起こります。[2]
タンパク質は高イオン強度下では溶解度が大きく異なるため、「塩析」は目的のタンパク質の精製を支援する非常に有用な手順です。硫酸アンモニウムは溶解度が高いため、沈殿によく使用されます。さらに、硫酸アンモニウムはホフマイスター系列で高いイオンを2つ形成します。これらの2つのイオンはホフマイスター系列の端に位置するため、硫酸アンモニウムはタンパク質構造を安定化させることもできます。[3]タンパク質に対する硫酸アンモニウムの溶解度挙動は、通常、飽和度の関数として表されます。実験的に測定された溶解度（mg/mLで表す）の対数を硫酸アンモニウムの飽和度に対してプロットすることで、溶解度曲線を作成できます。[4]
塩析のメカニズムでは、タンパク質の表面に密接に結合している水層（水和層）から塩が除去されます。水和層は、溶解性と適切な自然構造を維持する上で重要な役割を果たします。タンパク質と水の間には、主に3つの相互作用があります。荷電側鎖間のイオン水和、極性基と水間の水素結合、疎水性水和です。混合物に塩を加えると、水の表面張力が増加し、水と目的のタンパク質との間の疎水性相互作用が増加します。すると、目的のタンパク質は表面積を減少させ、溶媒との接触が減少します。これは、最終的に沈殿につながる折り畳みと自己会合によって示されます。タンパク質の折り畳みと自己会合は自由水を押し出し、エントロピーの増加につながり、このプロセスをエネルギー的に有利にします。[2]
手順
通常、硫酸アンモニウム濃度は段階的に増加させ、各段階で沈殿したタンパク質を回収します。これは通常、固体硫酸アンモニウムを添加することによって行われますが、硫酸アンモニウムの添加により溶液の体積が大幅に増加するため、所望の濃度を達成するために溶液に添加すべき硫酸アンモニウムの量を計算することは困難な場合があります。溶液に添加すべき硫酸アンモニウムの量は、公開されているノモグラムまたはオンライン計算機を使用して決定できます。[5]固体硫酸アンモニウムを直接添加すると溶液のpHが変化し、酵素活性の低下につながる可能性があります。[6]このような場合、固体硫酸アンモニウムを添加する代わりに、適切な緩衝液中の飽和硫酸アンモニウムを添加する方法が使用されます。どちらの方法でも、得られたタンパク質沈殿物を標準緩衝液に個別に溶解し、分析して総タンパク質含有量を決定することができます
添加する硫酸アンモニウム濃度は、目的のタンパク質の大部分を沈殿させながら、溶液中に最大量のタンパク質夾雑物を残す値まで増加させる必要があります。沈殿した目的のタンパク質は、その後、遠心分離によって回収し、標準緩衝液に溶解して次の精製段階のサンプルを調製することができます。
次の精製段階では、添加された塩をすべてタンパク質から除去する必要があります。その方法の1つは透析を使用することですが、透析は濃縮タンパク質をさらに希釈します。タンパク質から硫酸アンモニウムを除去するより良い方法は、沈殿したタンパク質をSDS、Tris-HCl、フェノールの混合物を含む緩衝液に混合し、混合物を遠心分離することです。この遠心分離で得られる沈殿物には、塩のない濃縮タンパク質が含まれます。[7]
用途
硫酸アンモニウム沈殿は、細胞タンパク質を迅速に大量に沈殿させることができるため、タンパク質精製の初期段階として有用な技術です。[4]また、ゲルろ過などの手順に続いて、精製の後期段階で希薄溶液からタンパク質を濃縮するためにもよく用いられます。この方法の欠点は、タンパク質とともに異なる物質が沈殿することが多く、イオンクロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィーなどの他の精製技術を実行する必要があることです。[3]
参考文献
- ^ 「硫酸アンモニウム」。PubChem 。米国国立医学図書館、国立生物工学情報センター。2017年5月5日閲覧
- ^ abc Wingfield P (2001年5月). 「硫酸アンモニウムを用いたタンパク質沈殿」. Current Protocols in Protein Science . 付録3 (1): A.3F.1–A.3F.8. doi :10.1002/0471140864.psa03fs13. ISBN 0471140864 . PMC 4817497 . PMID 18429073.
- ^ abc Duong-Ly KC, Gabelli SB (2014). 「硫酸アンモニウム沈殿を用いたタンパク質の塩析」. Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part C. Vol. 541. pp. 85– 94. doi :10.1016/B978-0-12-420119-4.00007-0. ISBN 9780124201194 PMID 24674064
- ^ ab Burgess RR (2009). 「第20章 タンパク質沈殿技術」.タンパク質精製ガイド 第2版. Methods in Enzymology. 第463巻. pp. 331–42 . doi :10.1016/S0076-6879(09)63020-2. ISBN 978-0-12-374536-1 PMID 19892180
- ^ 「硫酸アンモニウム計算機」EnCor Biotechnology Inc. 2013年4月19日閲覧。
- ^ Arslanian, Michael J.; Wakil, Salih J. (1975-01-01). 「[7a] ニワトリ肝臓由来の脂肪酸合成酵素」脂質パートB. Methods in Enzymology. 第35巻. pp. 59– 65. doi :10.1016/0076-6879(75)35138-0. ISBN 9780121819354ISSN 0076-6879. PMID 235706. 2020年10月31日閲覧
- ^ Wang W, Liu QJ, Cui H (2007年7月). 「硫酸アンモニウム分画後のフェノールによる迅速脱塩およびタンパク質回収」. Electrophoresis . 28 (14): 2358–60 . doi :10.1002/elps.200600743. PMID 17577882. S2CID 33402573.
