ベータプロペラフィターゼ
酵素群
BPP（PDBID：3AMR）。触媒的に重要なカルシウムイオン4～8は緑色で、それほど重要ではないと思われるカルシウムイオン1～3と9～11はマゼンタ色で示されている。[1]図には、 N末端とC末端、プロペラの「羽根」、そして活性部位に結合したミオイノシトールヘキサ硫酸（IHS、フィチン酸類似体）が示されている。

β-プロペラフィターゼ（BPP ）は、円形のβ-プロペラ構造を持つ酵素のグループ（タンパク質スーパーファミリー）です。BPPはフィターゼであり、フィチン酸とそのフィチン酸塩からリン酸基を除去（加水分解）できます。 [2]加水分解は段階的に起こり、通常、3つのリン酸基が結合したままのミオイノシトール三リン酸生成物で終わります。 [3] BPPの実際の基質はフィチン酸カルシウムであり、 [4]それを加水分解するために、BPPはCa 2+イオンを自身に結合させなければなりません。BPPは環境中で最も広く見られるフィターゼスーパーファミリーであり、土壌と水中のフィチン酸-リン循環に主要な役割を果たしていると考えられています。[5]別名がアルカリフィターゼであることが示すように、BPPは塩基性（または中性）環境で最もよく機能します。最適pHは6～9であり[2] 、これはフィターゼの中では独特である。[5]

潜在的な用途

2018年4月現在、BPPは商業的に利用されていませんが、将来的には利用される可能性があります。ヒスチジン酸性フィターゼ（HAP）は、現在動物飼料に使用されている唯一のフィターゼ群です。

動物飼料

農業では、単胃動物の飼料に、飼料栄養素の生物学的利用能を高めるために、組み換えフィターゼが一般的に添加されている。[6]これらの栄養素には、リン酸基の形でフィチン酸に結合しているリンが含まれる。牛などの反芻動物とは対照的に、豚や鶏などの単胃動物の腸内細菌は、動物の消化器系がリンを利用できるようにこれらの基を適切に加水分解することができない。このように、吸収されなかったリンは無駄になり、農業用排水によって動物の堆肥中に混入して環境に流れ込み、富栄養化を引き起こす可能性がある。フィチン酸は抗栄養素としても作用する。飼料中のカルシウムをキレート化し、その生物学的利用能を飼料中の総カルシウム含有量の最大60～70%まで低下させる可能性がある。フィターゼを添加すると、カルシウムの利用能が向上し、鉄と亜鉛の生物学的利用能も向上する。銅とマンガンの利用能も高まる可能性がある。アミノ酸の生物学的利用能は著しく向上しない。[7]

65℃を超える温度では不安定になることが多いヒスチジン酸性フィターゼ（HAP）と比較して、BPPは80〜85℃の高温に自然に耐えることができます。このような温度は、動物飼料の製造工程でペレット化する際によく使用されます。HAPとは異なり、BPPは中性またはアルカリ性の最適pHを持っているため、中性またはアルカリ性の環境で使用することができます。これにより、フィターゼの潜在的な用途が広がります。[2]魚やエビなど多くの動物は中性またはアルカリ性の消化管を持っているため、BPPは水生動物の飼料に使用できます。[8] BPPは、 ADP、GTP、NADHなどの他のリン酸を含む分子も加水分解するHAPとは異なり、フィチン酸に特異的です。[ 5]ただし、BPPは、現在のHAPよりも触媒的に2〜60倍以上遅いです。 HAPの比触媒活性は100～3000 U mg −1である。BPPの比触媒活性は通常50 U mg −1未満である。[2]このように活性が低いため、BPPの実用化にはさらなる研究が必要である。[5]

構造

2018 年 4 月現在、7 つの BPP結晶構造が知られています: 3AMR、3AMS、1H6L、1POO、2POO、1CVM、および 1QLG。

既知のBPPの質量は約35～68  kDaである。[5]ドーナツ型のβプロペラ構造は、6枚の反平行βシート構造、すなわち「ブレード」から構成される。これらのブレードのうち1枚は5枚のβシート（本稿冒頭の図のブレード番号5）から成り、残りのブレードは4枚のβシートから構成される。これらのブレード間には疎水性相互作用があり、これがプロペラ構造を保っていると考えられている。これらのブレードは酵素を貫通するトンネル状の穴を形成する。このトンネルには水分子が結合する。トンネルの手前には酵素の活性部位があり、結合するCa 2+イオンと特定の正電荷アミノ酸残基によって全体として正電荷を帯びている。この部位は負電荷を帯びたフィチン酸カルシウムと結合し、そこからリン酸を加水分解する。[2]

モチーフ

Huangら[10]によって発見されたBPPモチーフをBPP（PDBID: 1H6L）に示します。実際に強調表示されているモチーフはDAADDPAIW（赤）とNNVDIRY（緑）です。

2008年にHuangらが行った研究では、66個のBPPペプチド配列を比較し、研究したBPPの全てにおいて配列モチーフDA[A/T/E]DDPA[I/L/V]WとNN[V/I]D[I/L/V]R[Y/D/Q]が保存されていることが判明した。例えばR[Y/D/Q]は、配列にRとY、D、またはQ 、すなわちRY、RD、またはRQが含まれていることを意味する。 [10] 2014年にKumarらが行った研究では、44個のBPPを比較し、10個のモチーフが見つかった。そのうちの2つ、DDPAIW[VI][HN]PK[DN]P[ESA]KSとNN[F/V]D[I/V/L]は、研究したBPPの全てにおいて見つかった。これらは、2008年のHuangらの研究で見つかったものと類似していることが指摘された。[5]

カルシウム依存症と阻害剤

BPPはカルシウム依存性金属タンパク質である。その活性部位には、負に帯電したアミノ酸カルボキシル基を介して多数のカルシウム陽イオン（Ca 2+ ）が結合している。負に帯電したフィチン酸を電気的に好ましい状態に結合させるには、正のカルシウムイオンが必要である。結合は、フィチン酸の負に帯電したリン酸基と、フィチン酸に直接結合するBPPの特定の正のアミノ酸残基を介して起こる。[1] Ca 2+濃度もBPPの最適pHと熱安定性に影響を及ぼし、例えば、バチルス属KHU-10 BPPでは、60 °CおよびpH 6～9.5で10 mMのCaCl 2を添加すると活性が最高になる。CaCl 2 を添加しない場合、pHが40 °CおよびpH 6.5～8.5のときに活性が最高になる。[5]

Ca 2+が除去されると触媒活性が失われるため、Ca 2+ をキレートする EDTA はBPP を阻害します。カルシウム結合アミノ酸の特定の点突然変異も酵素機能を停止させます。Cd 2+、Mn 2+、Cu 2+、Ba 2+、Hg 2+、Zn 2+ 、 Co 2+ 、 Fe 2+などの二価イオンは、酵素内のCa 2+ を置き換えることで BPP を阻害します。 [5]これはおそらく、これらの陽イオンが、ファンデルワールス半径(WDV) が 0.99 Åの Ca 2+イオンと比較して小さすぎるためです。たとえば、Co 2+ のVDW は 0.74 Å であるため、Ca 2+と同じタスクを実行するには小さすぎると考えられます。ただし、Sr 2+イオンは、少なくとも特定のケースで、触媒機能を完全に失うことなくCa 2+を置き換えることができます。 Sr 2+のVDW半径は1.12Åで、Ca 2+のそれとほぼ同じです。[4]同様の異なるイオン間の適合性は、他の酵素でも見られます。[11]

高濃度のCa 2+は、BPPの触媒速度を限界まで高めることができます。Ca 2+濃度がこの限界を超えると、余分なCa 2+イオンが競合阻害剤として働き始めます。Ca 2+と結合していない高濃度の遊離フィチン酸もBPPを阻害します。これは、遊離フィチン酸を介したBPPに結合したCa 2+のキレート化を介して起こると考えられます。[4]

その他の阻害剤としては、酸素結合性（酸素結合性）のモリブデン酸塩、タングステン酸塩、バナジン酸塩などが挙げられる。これらの酸素アニオンによる阻害は、酵素活性部位において、加水分解中のフィチン酸のリン酸基の遷移状態と類似した三方両錐体錯体を形成するためであると示唆されている。フィチン酸から遊離するリン酸は、BPPの競合阻害剤として作用する。 [9]フィチン酸類似体であるミオイノシトールヘキサ硫酸塩（IHS）はBPPを阻害し、フィチン酸との類似性からBPPの構造研究の補助として用いられてきた（3AMR参照）。[2]

加水分解のメカニズム

2001年にShinらが提唱した加水分解機構では、 BPPに結合したCa 2+イオンは加水分解部位イオンと親和部位イオンに分けられます。加水分解部位では、Ca 2+が除去されようとしているリン酸が活性部位に結合するのを助けます。また、加水分解に関与する水分子をOH -イオンに変換することで活性化し、触媒反応中の遷移状態を安定化させます。親和部位イオンは活性部位へのフィチン酸の親和性を高め、加水分解中にフィチン酸を他のリン酸基から動かないようにします。加水分解は、 3つのリン酸を持つミオイノシトール生成物が得られるまで段階的に繰り返されます。[3]他の研究では、3つのリン酸を持つ生成物が支持されていますが、[ 12] [13] [14] [15]、BPP濃度が高く、インキュベーション時間が長いなどの極端な条件下では、より多くのリン酸が除去される可能性があります。[13]

BPP加水分解機構[3] 。モリブデン酸のようなオキシアニオンはリン酸加水分解の遷移状態と同様の錯体を形成することが示唆されている[9]（図では中間状態のみが示されている）。

Shinらが示唆する実際の加水分解は2段階で起こる。第2段階はより遅く、全体の反応速度を制限する。第1段階では、カルボニル基がリン酸のリンから電子を引き抜き、リン酸を電子不足、すなわち正電荷状態にする。同時に、OH基はリン酸中の名目上正電荷を持つリンに電子対を供与する。三方両錐形の中間状態が形成される。第2段階では、酸性アミノ酸残基（BH +）が結合中の酸素にプロトンを供与することで、リン酸エステル結合が切断される。こうしてリン酸基が切断される。[3]

加水分解経路

複数の加水分解経路が提案されているが、どれが正しいのか、あるいは複数の経路が存在するのかどうかは不明である。これらの加水分解経路を以下にまとめる。

提案されたBPP加水分解経路。[12] [13] [14] [15]極端な条件とは、フィチン酸濃度に比べてBPP濃度が高いこと、および/またはインキュベーション時間が長いことを意味します。[13]経路はフィチン酸（Ins(1,2,3,4,6)P 6）またはその塩であるフィチン酸カルシウムから始まります。例えば、Ins(1,3,5)P 3は、炭素1、3、および5にリン酸基が結合しています。

参照

参考文献

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