ライゲーション（分子生物学）
核酸断片を結合する技術
粘着末端ライゲーション

ライゲーションとは、2つのヌクレオチド、または2つの核酸断片を、リガーゼと呼ばれる酵素の作用によって1本の高分子鎖に結合することである。この反応では、一方のヌクレオチドの3'-ヒドロキシル末端ともう一方のヌクレオチドの5'-ホスホリル末端との間にリン酸ジエステル結合が形成され、その結果、2つのヌクレオチドが1本の鎖上に連続して連結される。ライゲーションは、DNAとRNAの両方で基本的に同じように機能する。一般的に、この反応には補因子（通常はATPまたはNAD + ）が関与する。真核生物のリガーゼはATP型に属し、NAD +型は細菌（例：大腸菌）に見られる。[1]

ライゲーションは、 DNA複製、転写、スプライシング、組み換えなど、数多くの細胞プロセスの一部として自然に起こるほか、 DNA断片を結合して組み換えDNA分子を作成する分子クローニング（外来DNA断片をプラスミドに挿入する場合など）においても必須の実験手順である。DNAリガーゼの発見は1967年にさかのぼり、分子生物学の分野における重要な出来事であった。[1]実験室でのライゲーションは、通常T4 DNAリガーゼを用いて行われる。これは、粘着末端断片だけでなく平滑末端断片も結合できるため、in vitroで広く使用されている。 [2]ただし、標準的なDNAリガーゼを使用しないライゲーション手順も一般的である。ヒトDNAリガーゼの異常は、免疫不全、放射線過敏症、発達障害を特徴とする病理学的障害に関連している。[3]

ライゲーション反応

ライゲーション反応のメカニズムは、I.ロバート・レーマンの研究室で初めて解明されました。[4] [5] DNAの2つの断片は、 DNAリガーゼによって連結されます。DNAリガーゼは、DNA鎖の片方の末端の3'-ヒドロキシル基（-OH）ともう一方の末端の5'-リン酸基（-PO4）との間にリン酸ジエステル結合を形成する触媒作用をします。動物やバクテリオファージでは、ライゲーションのエネルギー源としてATPが用いられますが、細菌ではNAD +が用い​​られます。[6]

DNAリガーゼはまずATPまたはNAD +と反応し、リガーゼ-AMP中間体を形成します。このAMPは、リガーゼの活性部位にあるリジンのεアミノ基にホスホラミド結合を介して結合しています。次に、このアデニリル基はDNA鎖の5'末端のリン酸基に転移され、DNA-アデニレート複合体を形成します。最後に、一方のDNA鎖の末端3'-ヒドロキシル基が、もう一方のDNA鎖の活性化された5'-ホスホリル基に求核攻撃することで、両DNA末端間にホスホジエステル結合が形成されます。[4]

DNA の切れ目( 二本鎖 DNA の一方の鎖の切断) は、リガーゼによって非常に効率的に修復できます。ただし、2 つの別々の DNA 末端をライゲーションする場合は、ライゲーション反応を進める前に 2 つの末端が一緒になる必要があるため、ライゲーションを複雑にすることがあります。研究室で行われるライゲーション反応、つまり粘着末端を持つ DNA のライゲーションでは、突出している DNA 鎖がすでにアニールされている可能性があるため、DNA の 2 つの切れ目を修復することに相当するため、比較的効率的なプロセスです。ただし、 DNA がアニールするための突出末端がない平滑末端のライゲーションでは、末端がライゲーションされる前にランダム衝突によって揃う必要があるため、結果的に効率のはるかに低いプロセスになります。[7]大腸菌 由来のDNAリガーゼは、分子が密集した状態以外では平滑末端DNAをライゲーションできないため、実験室でのライゲーションには通常使用されません。代わりに、T4ファージ由来のDNAリガーゼが用いられます。これは、平滑末端DNAだけでなく一本鎖DNAもライゲーションできるためです。[8] [6]

結紮に影響を与える要因

実験室において、酵素を介した化学反応に影響を与える要因は、当然のことながらライゲーション反応にも影響を与えます。具体的には、酵素と反応物の濃度、反応温度、インキュベーション時間などが挙げられます。ライゲーションは、分子間反応と分子内反応の両方が関与する可能性があるため複雑ですが、多くのライゲーション反応（例えば、DNA断片をベクターにライゲーションする反応）では、目的とするライゲーション産物はまず分子間反応、つまり2つの異なるDNA分子間で反応し、その後、分子内反応によって分子を封鎖して環状化する必要があります。効率的なライゲーションには、追加のアニーリング工程も必要です。

ライゲーション中に新たなリン酸ジエステル結合を形成する3つのステップは、酵素によるアデニリル化、DNAへのアデニリル基の転移、そしてニックシーリングである。Mg(2+)は触媒の補酵素であるため、Mg(2+)濃度が高いとライゲーション効率は高くなる。Mg(2+)濃度が制限されている場合、ニックシーリングがプロセスの律速反応となり、アデニリル化されたDNA中間体は溶液中に留まる。このような酵素のアデニリル化は、LIG1の弱点であるアデニリル化されたDNA中間体への再結合を阻害し、それらが固定されていない場合はリスクとなる。[9]

DNA濃度

DNA濃度は、ライゲーションの速度、そしてライゲーションが分子間反応か分子内反応かに影響を与える可能性があります。ライゲーションとは、DNAの末端同士を結合させることですが、各DNA断片には2つの末端があり、それらの末端が適合していれば、DNA分子は自身の末端同士を結合して環状化することができます。DNA濃度が高い場合、DNA分子の一方の末端が別のDNAの末端と出会い、分子間ライゲーションを形成する可能性が高くなります。DNA濃度が低い場合、DNA分子の一方の末端が同じ分子のもう一方の末端と出会う可能性が高くなるため、DNAを環状化する分子内反応の可能性が高くなります。また、線状DNAの形質転換効率は環状DNAよりもはるかに低く、DNAを環状化するにはDNA濃度を高くしすぎてはいけません。原則として、DNAの総濃度は10 μg/ml未満である必要があります。[10]

DNA 断片の相対的な濃度、長さ、緩衝液の条件も、分子間反応と分子内反応のどちらが優先されるかに影響を与える要因となります。

DNA濃度は、コバルトヘキサミンなどの凝縮剤やスペルミジンなどの生体ポリアミン、あるいは酵素の有効濃度を高めるポリエチレングリコール（PEG）などの密集剤を加えることで人工的に高めることができる。 [11] [12]ただし、コバルトヘキサミンなどの添加剤は分子間反応のみを引き起こす可能性があり、[11]プラスミドDNAの形質転換に適した環状DNAではなく線状コンカテマーを生成するため、プラスミドライゲーションには望ましくない。プラスミドライゲーションに添加剤を使用する必要がある場合は、分子間ライゲーションだけでなく分子内ライゲーションも促進できるPEGの使用が好ましい。[13]

リガーゼ濃度

酵素では一般的に、リガーゼ濃度が高いほどライゲーション速度は速くなります。平滑末端ライゲーションは粘着末端ライゲーションよりも効率がはるかに低いため、平滑末端ライゲーションではより高濃度のリガーゼが使用されます。より高速なライゲーションのために、高濃度DNAリガーゼをPEGと組み合わせて使用​​することも可能であり、これらは迅速なライゲーション用に設計された市販のキットによく含まれています。[14] [15]

温度

ライゲーション反応の温度を考える際には、2 つの問題が関係します。1 つ目は DNA リガーゼ活性の最適温度である 37 ° C であり、2 つ目はライゲーションされる DNA 末端の融解温度(T m ) です。融解温度は DNA オーバーハングの長さと塩基構成に依存します。G と C の数が多いほど、GC 塩基対間に形成される水素結合が 3 つであるのに対し、AT 塩基対の場合は 2 つであるため、T mは高くなります。また、断片間の塩基のスタッキングもいくらか影響します。ライゲーション反応を効率的に進めるためには、末端が安定してアニールされる必要があり、ライゲーション実験では、DNA 末端のT mは通常 37 ° C よりもはるかに低くなります。したがって、付着末端をライゲーションするための最適温度は、DNA リガーゼ活性に最適な温度と末端が会合できるT mとの間の妥協点となります。 [16] しかし、異なる制限酵素は異なる末端を生成し、これらの酵素によって生成される末端の塩基構成も異なる場合があり、融解温度、したがって最適温度は使用する制限酵素によって大きく異なる可能性があり、ライゲーションの最適温度は末端に応じて4〜15℃の間となる可能性がある。[ 17] [18]ライゲーションでは、同じ反応混合物中の異なる制限酵素から生成された末端をライゲーションすることも多いため、特定のライゲーション反応に最適な温度を選択することは現実的ではなく、ほとんどのプロトコルでは単に12〜16℃、室温、または4℃が選択されます。4 ℃でライゲーションを行う場合は、ライゲーション混合物を冷蔵庫に一晩以上放置するなどして、ライゲーション反応時間を延長する必要があります。

バッファ構成

使用する緩衝液のイオン強度はライゲーション反応に影響を与える可能性があります。また、存在する陽イオンの種類もライゲーション反応に影響を与える可能性があります。例えば、過剰なNa +はDNAを硬くし、分子間ライゲーションの可能性を高めます。一価陽イオンの濃度が高い場合（200 mM以上）、ライゲーション反応はほぼ完全に阻害される可能性があります。[19]ライゲーションに使用される標準的な緩衝液は、イオンの影響を最小限に抑えるように設計されています。[20]

スティッキーエンドライゲーション

制限酵素は、消化した DNA にさまざまな末端を生成できますが、クローニング実験で最も一般的に使用される制限酵素は、粘着末端または付着末端と呼ばれる 4 塩基の一本鎖オーバーハングを生成します (例外として、 2 塩基のオーバーハングを生成するNde Iや、平滑末端を生成する酵素などがあります)。これらの粘着末端は、他の適合する末端とアニールして、粘着末端 (または付着末端) ライゲーションでライゲーションされます。 たとえば、 Eco RI はAATT 末端を生成し、A と T は C と G よりも融点が低いため、その融解温度 T m は約 6 ° Cと低くなります。[21]ほとんどの制限酵素では、生成されたオーバーハングの T mは約 15 ° Cです。[20] 実用的には、粘着末端ライゲーションは 12〜16 ° C、室温、または 4 ° C でより長時間実行されます。

プラスミドベクターにDNA断片を挿入する場合、異なる末端を生成するように2種類の制限酵素でDNAを消化することが好ましい。2種類の異なる末端を生成することで、挿入断片のないベクターの再ライゲーションを防ぐことができ、また、断片を方向性を持って挿入することができる。

2 つの異なる部位を使用できない場合は、インサートのない再環状ベクター DNA の高いバックグラウンドを回避するために、ベクター DNA を脱リン酸化する必要がある場合があります。末端にリン酸基がないとベクターはそれ自身にライゲーションできませんが、リン酸基を持つインサートにライゲーションできます。脱リン酸化は一般に子牛腸アルカリホスファターゼ(CIAP) を使用して行われます。この酵素は消化された DNA の 5' 末端からリン酸基を除去しますが、CIAP は不活性化が容易ではなく、CIAP を除去する追加ステップなしではライゲーションを妨害し、ライゲーションに失敗する可能性があることに注意してください。CIAP は過剰量使用してはならず、必要な場合にのみ使用してください。エビアルカリホスファターゼ(SAP) または南極ホスファターゼ (AP) は簡単に不活性化できるため、適切な代替手段です。

平滑末端ライゲーション

平滑末端ライゲーションでは、突出末端の塩基対形成は行われないため、任意の平滑末端を別の平滑末端にライゲーションすることができます。平滑末端は、SmaIやEco RVなどの制限酵素によって生成されます。平滑末端クローニングの主な利点は、平滑末端は通常PCRで生成されるため、目的のインサートの配列中に制限酵素部位を必要としないことです。PCRで生成された平滑末端DNA断片は、制限酵素消化によって生成された平滑末端ベクターにライゲーションすることができます。

しかし、平滑末端ライゲーションは粘着末端ライゲーションに比べて効率がはるかに低く、通常、反応時間は粘着末端ライゲーションの100倍遅くなります。平滑末端には突出末端がないため、ライゲーション反応は平滑末端間のランダムな衝突に依存し、結果として効率が大幅に低下します。この低い効率を補うため、使用するリガーゼの濃度は粘着末端ライゲーションよりも高くなります（10倍以上）。平滑末端ライゲーションでは、末端間の衝突の可能性を高めるため、使用するDNA濃度も高くなります。また、平滑末端ライゲーションでは、より長いインキュベーション時間が必要となる場合もあります。

ベクターにライゲーションする両端が平滑末端である場合、自己ライゲーションを最小限に抑えるため、ベクターを脱リン酸化する必要があります。これはCIAPを用いて行うことができますが、前述のように使用には注意が必要です。ベクターは脱リン酸化されており、ライゲーションには5'-リン酸基の存在が必要であるため、インサートはリン酸化する必要があります。平滑末端PCR産物は通常5'-リン酸基を欠いているため、T4ポリヌクレオチドキナーゼ処理によってリン酸化する必要があります。[22]

平滑末端ライゲーションも高濃度ATPによって可逆的に阻害される。[23]

PCRでは通常、平滑末端のPCR産物が生成されますが、Taqポリメラーゼを用いたPCRでは、PCR産物の3'末端にアデニン（A）が付加される可能性があることに注意してください。この特性は、PCR産物の末端をベクターのT末端にアニールさせる TAクローニングに利用できます。したがって、 TAライゲーションは粘着末端ライゲーションの一種です。平滑末端ベクターは、ターミナルトランスフェラーゼを用いてジデオキシチミジン三リン酸（ddTTP）と反応させることで、TAライゲーション用ベクターに変換できます。

一般的なガイドライン

環状プラスミドへのインサートのクローニングの場合:

  • プラスミドは再循環する必要があるため、使用する DNA の総濃度は 10 μg/ml 未満にする必要があります。
  • インサートとベクターのモル比は通常3:1程度です。この比率が非常に高いと、複数のインサートが生成される場合があります。インサートのサイズに応じて比率を調整したり、1:1などの他の比率を使用することも可能です。

トラブルシューティング

場合によっては、連結反応で目的の連結生成物が生成されないことがありますが、その理由としては次のようなものが考えられます。

  • 損傷したDNA – ライゲーションのためのDNA調製中に紫外線を過剰に照射すると、DNAが損傷し、形質転換効率が著しく低下する可能性があります。長時間にわたりUVトランスイルミネーターでDNAを操作する必要がある場合は、DNAへの損傷が少ない高波長の紫外線（365 nm）を使用する必要があります。ただし、電気泳動バッファーにシチジンまたはグアノシンを1 mMの濃度で添加すると、DNAを損傷から保護できる可能性があります。[24]
  • CIAP の誤った使用、または CIAP の非効率的な不活性化または除去。
  • 使用されたDNAの量が多すぎます。
  • 不完全なDNA消化– ベクターDNAが完全に消化されていないと、高いバックグラウンドが発生します。これは、インサートを含まない対照実験を行うことで確認できます。インサートが完全に消化されていないと、適切にライゲーションされず、環状化しません。PCR産物を消化する際には、PCRに使用するオリゴヌクレオチドの5'末端に十分な塩基が付加されていることを確認してください。多くの制限酵素は、効率的な消化のために最低限必要な塩基対数を必要とします。必要な最小塩基対に関する情報は、New England Biolabsのカタログなど、制限酵素の供給元から入手できます。[25]
  • 不完全なライゲーション – 平滑末端DNA（例：SmaI）や融点の低い粘着末端DNA（例： NdeI ）では、より多くのリガーゼとより長いインキュベーション時間が必要となる。 [26]
  • 連結された遺伝子挿入物から発現されたタンパク質は細胞に対して毒性があります。
  • 挿入された配列がプラスミド DNA の配列と相同であるため、削除が発生します。
  • 阻害剤として作用する高濃度のEDTAまたはその塩。[27]

DNAライゲーションの他の方法

市販のDNAクローニングキットの中には、通常のDNAリガーゼを必要としない、別のライゲーション法を採用しているものもあります。これらの方法を用いると、クローニングがはるかに迅速になり、クローニングしたDNAインサートを別のベクターに容易に移すことが可能になります。しかしながら、これらの方法は特別に設計されたベクターとコンポーネントを使用する必要があり、柔軟性に欠ける場合があります。

トポイソメラーゼ媒介ライゲーション

ライゲーションにはリガーゼの代わりにトポイソメラーゼを用いることができ、ベクターやインサートの制限酵素消化を必要とせず、より迅速にクローニングを行うことができます。このTOPOクローニング法では、線状ベクターの末端にトポイソメラーゼIを付加することで活性化されます。この「TOPO活性化」ベクターはPCR産物の両5'末端にライゲーションすることでPCR産物を受け入れ、その過程でトポイソメラーゼが放出され、環状ベクターが形成されます。[28]

相同組換え

リガーゼを使わないクローニング方法としては、 DNA組換え法があり、例えばゲートウェイクローニングシステムで用いられている。[29] [30]クローニングベクター（この方法ではエントリークローンと呼ばれる）にクローニングされた遺伝子は、組換えによって様々な発現ベクターに容易に導入することができる。[31]

DNAリガーゼの例と応用

研究対象生物には様々な種類のリガーゼが存在します。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）依存性リガーゼは、 20世紀後半に大腸菌として知られる細菌から発見・単離されました。それ以来、このモデルはDNAリガーゼファミリーの研究に広く用いられてきました。また、このリガーゼはすべての細菌に存在します。大腸菌に存在する遺伝子の例としては、細菌の増殖に重要な機能を持つLigAやLigBなどが挙げられます。[32]

哺乳類では、ヒトを含む3つの遺伝子、すなわちLig1、Lig3、Lig4が同定されました。すべての真核生物は、Lig遺伝子によってコードされる複数タイプのDNAリガーゼを持っています。[33]真核生物のリガーゼの中で最も小さいものはクロレラウイルスDNAリガーゼ（ChVLig）です。これはわずか298個のアミノ酸しか含んでいません。ChVLigが細胞内で唯一のリガーゼ源である場合、それは有糸分裂の発達と出芽酵母における非相同末端結合をサポートし続けることができます。[34] DNAリガーゼI（Lig1）は、岡崎フラグメントのライゲーションを担っています。これは919個のアミノ酸で構成されています。DNA複製の複雑なプロセスにおいて、DNAリガーゼIはタンパク質相互作用によって複製機構にリクルートされます。Lig1は、植物や酵母の細胞分裂で役割を果たしています。Lig1遺伝子のノックアウトは酵母や一部の植物の芽にとって致命的です。しかしながら、マウスの胚発生の研究では、成長過程の中期まではDNAリガーゼIなしで胚が発生することが示されている。[35]

酵素ライゲーションは、DNAナノ構造に関する様々な研究に利用されており、効率性と安定性の向上につながっています。その方法の一つは、DNAの共有結合、すなわちホスホジエステル結合とニックのシーリングです。これらの構造の再構築はライゲーションの助けを借りて行われます。例えば、T4 DNAリガーゼは、DNAの3プライム末端と5プライム末端の間のニックをシーリングし、強力なホスホジエステル結合を形成する触媒として機能します。ライゲーションされた構造は、より高い熱安定性を示します。[36] T4 DNAリガーゼは、既に述べた触媒作用をはじめ、多くの貴重な特性を有していますが、DNA鎖間のギャップのシーリング、ニッククローシング活性、DNA損傷の修復なども担っています。[2]

ナノ構造構築において、分子生物学研究ではssDNAが重要な応用モデルとなっています。T4 DNAリガーゼは短いssDNA断片を環状化するために使用されますが、二次構造の形成によりプロセスが複雑になります。一方、Taq DNAリガーゼは耐熱性酵素であり、高温（それぞれ45、55、65℃）で使用できます。これらの温度域では二次構造の安定性が低下するため、オリゴヌクレオチドの環状化効率が向上します。ナノ構造の運動学的、生物学的、その他のパラメータは、DNAリング内の二次構造の存在によって影響を受けます。しかし、Taq DNAライゲーションは、2本の相補的なDNA鎖が完全に対合し、間にギャップがない場合にのみ発生します。[37]

リガーゼ活性、変異、欠損の分析は、疾患、病状の進行、および関連するまれな後天性または遺伝性症候群（例：DNAリガーゼIV症候群）を調査するための医薬品設計および生物学的研究で広く使用されています。[38] [39] [40] [41]

ライゲーション法は分子生物学のクローニング技術で広く普及しており、ライガーゼ連鎖反応（LCR）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるライゲーションプローブの増幅を利用してゲノム内の特定のヌクレオチド配列を定義および特徴付けるために適用されている。[42]

分析

ライゲーション法はDNA分析法としても利用できる。[43]ローリングサークル増幅法を用いる技術もある。[43]最も注目すべきは、Smolinaら（2007年）とSmolinaら（2008年）による蛍光in situハイブリダイゼーションとペプチド核酸を用いた手法である。[43]彼らはこの手法を開発し、細菌染色体の分析に用いた。[43]

参照

参考文献

  1. ^ ab Shuman S (2009 年6月). 「DNAリガーゼ：進歩と展望」. The Journal of Biological Chemistry . 284 (26): 17365– 17369. doi : 10.1074/jbc.R900017200 . PMC  2719376. PMID  19329793.
  2. ^ ab Su T, Liu F, Chang Y, Guo Q, Wang J, Wang Q, Qi Q (2019年6月). 「ファージT4 DNAリガーゼは、細菌染色体DSB修復を単一成分非相同末端結合として媒介する」. Synthetic and Systems Biotechnology . 4 (2): 107– 112. doi :10.1016/j.synbio.2019.04.001. PMC 6525309. PMID  31193309 . 
  3. ^ Tomkinson AE, Naila T, Khattri Bhandari S (2020年2月). 「ヒト疾患におけるDNAリガーゼ活性の変化」. Mutagenesis . 35 (1): 51– 60. doi :10.1093/mutage/gez026. PMC 7317150. PMID  31630206 . 
  4. ^ ab Kresge N, Simoni RD, Hill RL (2007年1月). 「DNA結合への洞察：I. Robert LehmanのDNAリガーゼに関する研究」. The Journal of Biological Chemistry . 282 (2): e1 – e3 . doi : 10.1016/S0021-9258(20)73504-0 .
  5. ^ Modorich P, Lehman IR (1973年11月). 「デオキシリボ核酸リガーゼ．大腸菌由来の酵素によって触媒される反応の定常状態速度論的解析」（PDF） . The Journal of Biological Chemistry . 248 (21): 7502– 7511. PMID  4355585.
  6. ^ ab Stryer L (2007)。生化学(第 3 版)。フリーマン。 658–659ページ。ISBN 9780716787242。
  7. ^ Saunders VA (2012年12月6日). 微生物遺伝学のバイオテクノロジーへの応用:遺伝子導入と操作の原理と技術. Springer. ISBN 9781461597964。
  8. ^ Old RW, Primrose SB (1994-09-27). 遺伝子操作の原理 - 遺伝子工学入門（第5版）. Blackwell Scientific. p. 37. ISBN 9780632037124。
  9. ^ Taylor MR, Conrad JA, Wahl D, O'Brien PJ (2011年7月). 「ヒトDNAリガーゼIの速度論的メカニズムは、ライゲーション効率を低下させる律速段階におけるマグネシウム依存的な変化を明らかにする」The Journal of Biological Chemistry . 286 (26): 23054– 23062. doi : 10.1074/jbc.m111.248831 . PMC 3123073 . PMID  21561855. 
  10. ^ Sambrook J, Russell D. 「第1章 プラスミドと分子クローニングにおけるその有用性」『分子クローニング 実験マニュアル』第1巻（第3版）pp.  1.20-1.21 . ISBN  978-0-87969-577-4。
  11. ^ ab Rusche JR, Howard-Flanders P (1985年3月). 「ヘキサミンコバルトクロリドはT4 DNAリガーゼによる平滑末端DNA断片の分子間ライゲーションを促進する」. Nucleic Acids Research . 13 (6): 1997– 2008. doi :10.1093/nar/13.6.1997. PMC 341130. PMID 4000951  . 
  12. ^ Zimmerman SB, Pheiffer BH (1983年10月). 「高分子の密集によりラット肝臓または大腸菌由来のDNAリガーゼによる平滑末端ライゲーションが可能になる」. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 80 (19): 5852– 5856. Bibcode :1983PNAS...80.5852Z. doi : 10.1073/pnas.80.19.5852 . PMC 390173. PMID 6351067  . 
  13. ^ 林 功、中澤 正之、石崎 雄二、平岡 暢、大林 章 (1986年10月). 「ポリエチレングリコール存在下におけるT4 DNAリガーゼによる分子間および分子内ライゲーションの制御」.核酸研究. 14 (19): 7617– 7631. doi :10.1093/nar/14.19.7617. PMC 311784. PMID  3022231 . 
  14. ^ 「FAQ」. NEB .
  15. ^ 「クイックライゲーションキット」NEB。
  16. ^ Old RW, Primrose SB (1994-09-27). 遺伝子操作の原理 - 遺伝子工学入門（第5版）. Blackwell Scientific. p. 36. ISBN 9780632037124。
  17. ^ Ferretti L, Sgaramella V (1981年1月). 「T4 DNAリガーゼによるII型制限酵素末端の結合における温度依存性」. Nucleic Acids Research . 9 (1): 85– 93. doi :10.1093/nar/9.1.85. PMC 326670. PMID 6259621  . 
  18. ^ Dugaiczyk A, Boyer HW, Goodman HM (1975年7月). 「EcoRIエンドヌクレアーゼで生成されたDNA断片の線状構造および環状構造へのライゲーション」. Journal of Molecular Biology . 96 (1): 171– 184. doi :10.1016/0022-2836(75)90189-8. PMID  169355.
  19. ^ Raae AJ, Kleppe RK, Kleppe K (1975年12月). 「T4ポリヌクレオチドリガーゼに対する塩およびポリアミンの速度論と影響」. European Journal of Biochemistry . 60 (2): 437– 443. doi : 10.1111/j.1432-1033.1975.tb21021.x . PMID  173544.
  20. ^ ab Lucotte G, Baneyx F (1993).分子クローニング技術入門. Wiley-Blackwell. p. 156. ISBN 978-0471188490。
  21. ^ Mertz JE, Davis RW (1972年11月). 「R1制限酵素によるDNA切断は付着末端を生成する」. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 69 (11): 3370– 3374. Bibcode :1972PNAS...69.3370M. doi : 10.1073/pnas.69.11.3370 . PMC 389773. PMID  4343968 . 
  22. ^ 「クローニングガイド」New England Biolabs Inc.
  23. ^ Ferretti L, Sgaramella V (1981年8月). 「T4 DNAリガーゼの平滑末端結合活性の特異的かつ可逆的な阻害」. Nucleic Acids Research . 9 (15): 3695– 3705. doi :10.1093/nar/9.15.3695. PMC 327385. PMID 6269089  . 
  24. ^ Gründemann D, Schömig E (1996年11月). 「分取アガロースゲル電気泳動中のDNAの紫外線による損傷からの保護」BioTechniques . 21 (5): 898– 903. doi : 10.2144/96215rr02 . PMID  8922632. S2CID  32248907.
  25. ^ 「DNA断片の末端近くでの切断」New England Biolabs Inc.
  26. ^ Chang EL, Ge B, Lee MA, So MA, Wang WE (2005). 「NdeI消化断片のライゲーション効率の調査」(PDF) . Journal of Experimental Microbiology and Immunology . 7 : 68– 72. 2012年10月29日閲覧.(この論文には、 Nde I を 4 塩基カッターとして記述する誤りがあることに注意してください。)
  27. ^ 「7つの必須のヒントでDNAライゲーションを最適化する - 米国」www.thermofisher.com . 2023年1月10日閲覧。
  28. ^ 「TOPO®クローニングを支える技術」Invitrogen。
  29. ^ Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS (2009). 「タンパク質発現のためのゲートウェイクローニング」.ハイスループットタンパク質発現および精製. Methods in Molecular Biology. Vol. 498. pp. 31–54. doi :10.1007/978-1-59745-196-3_3. ISBN 978-1-58829-879-9. PMID  18988017。
  30. ^ 「クローニング方法 - 組換えクローニングシステム」EMBL。
  31. ^ 「Gateway®組換えクローニングテクノロジー」Invitrogen。
  32. ^ Sriskanda V, Shuman S (2001年12月). 「大腸菌における第二のNAD(+)依存性DNAリガーゼ（LigB）」. Nucleic Acids Research . 29 (24): 4930– 4934. doi :10.1093/nar/29.24.4930. PMC 97608. PMID  11812821 . 
  33. ^ Sun L, Liu X, Song S, Feng L, Shi C, Sun Z, et al. (2021-11-12). 「乳がんにおける予後バイオマーカーとしてのLIG1およびLIG3の同定」. Open Medicine . 16 (1): 1705– 1717. doi :10.1515/med-2021-0388. PMC 8590111. PMID  34825062 . 
  34. ^ Samai P, Shuman S (2011年4月). 「クロレラウイルスDNAリガーゼのヌクレオチジルトランスフェラーゼドメインのDNAインターフェースの機能解析」. The Journal of Biological Chemistry . 286 (15): 13314– 13326. doi : 10.1074/jbc.M111.226191 . PMC 3075678. PMID  21335605 . 
  35. ^ Waterworth WM, Kozak J, Provost CM, Bray CM, Angelis KJ, West CE (2009年6月). 「DNAリガーゼ1欠損植物は重篤な生育障害を示し、DNAの一本鎖切断および二本鎖切断の修復が遅れる」. BMC Plant Biology . 9 (1): 79. Bibcode :2009BMCPB...9...79W. doi : 10.1186/1471-2229-9-79 . PMC 2708163. PMID  19558640 . 
  36. ^ Bai T, Zhang J, Huang K, Wang W, Chen B, Li Y, et al. (2022年8月). 「酵素ライゲーション処理によるDNAナノ構造の再構成」. Nucleic Acids Research . 50 (14): 8392– 8398. doi :10.1093/nar/gkac606. PMC 9371897. PMID  35880584 . 
  37. ^ Lei C, Li SY, Liu JK, Zheng X, Zhao GP, Wang J (2017年5月). 「CCTL法（Cpf1支援切断およびTaq DNAリガーゼ支援ライゲーション）による大規模DNA構造のin vitro編集の効率化」. Nucleic Acids Research . 45 (9): e74. doi :10.1093/nar/gkx018. PMC 5436000. PMID  28115632 . 
  38. ^ Huang M, Dong G, Lu X, Xiao F, Zhou Q, Zhang S (2022年10月). 「骨髄異形成症候群が疑われる血清IgG値の上昇を伴うDNAリガーゼIV欠損症：症例報告」. BMC Pediatrics . 22 (1) 588. doi : 10.1186/s12887-022-03655-x . PMC 9552496. PMID  36221079 . 
  39. ^ Altmann T, Gennery AR (2016年10月). 「DNAリガーゼIV症候群：レビュー」. Orphanet Journal of Rare Diseases . 11 (1) 137. doi : 10.1186/s13023-016-0520-1 . PMC 5055698. PMID  27717373 . 
  40. ^ Chen X, Zhong S, Zhu X, Dziegielewska B, Ellenberger T, Wilson GM, et al. (2008年5月). 「細胞DNA複製および修復を標的とするヒトDNAリガーゼ阻害剤の合理的設計」. Cancer Research . 68 (9): 3169– 3177. doi :10.1158/0008-5472.can-07-6636. PMC 2734474. PMID  18451142 . 
  41. ^ Enders A, Fisch P, Schwarz K, Duffner U, Pannicke U, Nikolopoulos E, et al. (2006年4月). 「DNAリガーゼIVの変異による重症型ヒト複合免疫不全症」. Journal of Immunology . 176 (8): 5060– 5068. doi :10.4049/jimmunol.176.8.5060. hdl : 1885/25570 . PMID  16585603. S2CID  1342869.
  42. ^ Lohman GJ, Zhang Y, Zhelkovsky AM, Cantor EJ, Evans TC (2014年2月). 「クロレラウイルスDNAリガーゼによるDNA-RNAハイブリッドヘリックスにおける効率的なDNAライゲーション」. Nucleic Acids Research . 42 (3): 1831– 1844. doi :10.1093/nar/gkt1032. PMC 3919565. PMID 24203707  . 
  43. ^ abcd Conze T, Shetye A, Tanaka Y, Gu J, Larsson C, Göransson J, et al. (2009-07-19). 「DNAライゲーションによる遺伝子、転写産物、タンパク質の分析」. Annual Review of Analytical Chemistry . 2 (1). Annual Reviews : 215– 239. Bibcode :2009ARAC....2..215C. doi :10.1146/annurev-anchem-060908-155239. PMID:  20636060.
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