分岐DNAアッセイ

生物学において、分岐DNAアッセイは、核酸分子を検出するために使用されるシグナル増幅アッセイ（標的増幅アッセイとは対照的）である。[ 1 ]

方法

分岐DNAアッセイは、シャーレまたはその他の固体支持体（例：プラスチック製のディップスティック）から始まります。シャーレには、溶液中に突き出た小さな一本鎖DNA分子（または鎖）が散りばめられています。これらは捕捉プローブDNA分子と呼ばれます。次に、エクステンダーDNA分子を加えます。各エクステンダーは2つのドメインを持ちます。1つは捕捉DNA分子とハイブリダイズするドメイン、もう1つは表面から突き出ているドメインです。エクステンダーの目的は2つあります。1つは、標的DNA分子が結合できる表面積を増やすことです。2つ目として、アッセイを様々な標的DNA分子の検出に容易に適応させることです。

捕捉分子と伸長分子が配置され、ハイブリダイズしたら、サンプルを添加できます。サンプル中の標的分子は伸長分子に結合します。その結果、捕捉プローブが点在する塩基が形成され、捕捉プローブは伸長プローブとハイブリダイズし、伸長プローブは標的分子とハイブリダイズします。

この時点でシグナル増幅が起こります。2つのドメイン（最初のエクステンダーに類似）を持つラベルエクステンダーDNA分子が追加されます。ラベルエクステンダーは標的とプレアンプ分子にハイブリダイズします。プレアンプ分子は2つのドメインを持ちます。まずラベルエクステンダーに結合し、次にアンプ分子に結合します。アンプ分子の一例として、酵素アルカリホスファターゼに結合したオリゴヌクレオチド鎖が挙げられます。

図式的に言えば、このプロセスは次のように表すことができます。

ベース → キャプチャープローブ → エクステンダー → ターゲット → ラベルエクステンダー → プリアンプ → アンプ

プロセス

分岐DNAアッセイでは、数種類の異なる短い一本鎖DNA分子（オリゴヌクレオチド）が使用されます。捕捉オリゴヌクレオチドと捕捉伸長オリゴヌクレオチドは標的核酸に結合し、固体支持体上に固定します。標識オリゴヌクレオチドと分岐DNAは、固定された標的核酸を検出します。標的を固体支持体に固定することで、徹底的な洗浄が容易になり、偽陽性の結果が減少します。標的が固体支持体に結合した後、酵素（アルカリホスファターゼなど）と結合した分岐DNAによって検出できます。分岐DNAは、捕捉ハイブリッドが占有していない領域で特異的なハイブリダイゼーションによってサンプル核酸に結合します。DNAの分岐により、酵素によるDNAの非常に高密度な修飾が可能になり、これはアッセイの高感度化に重要です。酵素は基質の反応を触媒し、光（ルミノメーターで検出可能）を発生します。放出される光の量は、サンプル中に存在する特定の核酸の量に応じて増加します。分岐DNAの設計とそれが調査対象の核酸とハイブリダイズする方法は、bDNAアッセイの世代ごとに異なります。[ 2 ]

世代

第一世代のbDNAアッセイでは、多数の「アルカリホスファターゼプローブ」分子（増幅因子）が結合した分岐DNA分子を直接使用します。このプローブ分子は標識延長因子に結合し、その後標的分子に結合します。このアッセイでは、約10,000～10,000,000個の分子を正確に定量できます。[ 2 ]

第二世代のアッセイでは、「プリアンプ」分子を追加することで感度をさらに高めています。プリアンプは標識エクステンダーと複数のアンプ分子を結合し、シグナルを大幅に増強します。これにより、500分子まで検出可能です。[ 2 ]

第3世代、いわゆる「システム8」アッセイは、イソグアニン残基とイソシトシン残基を用いて、増幅部と前置増幅部と標的との間の非特異的ハイブリダイゼーションを防止します。これらの残基は本来、標識延長部とのみ結合するはずですが、長すぎると標的にも結合し、偽陽性を引き起こします。非特異的ハイブリダイゼーションを防止することで、これら2つの分子のより長いバージョンを使用できるようになります。これにより、シグナルの増幅が促進され、血液1mLあたりHIV-RNA100コピーという検出限界を実現できます。[ 2 ]このアッセイは1997年にChiron Diagnostics社の下で開発され、2005年から2006年まではBayer Diagnostics社が「Quantiplex」または「VERSANT」技術として所有していました[ 3 ] 。 [ 4 ] 2025年現在、「VERSANT」ブランドはSiemens社が所有しているようです。[ 5 ]

第四世代アッセイの定義は広く合意されているわけではないが、だからといって改良が止まったわけではない。例えば、2005年の特許では、一塩基多型の検出に使用できるほど特異性が向上している。[ 3 ]

用途と利点

このアッセイは、多くの種類の RNA または DNA ターゲットを検出および定量するために使用できます。このアッセイでは、分岐 DNA をテストするサンプルと混合します。検出は非放射性法を使用して行われ、検出する核酸を事前に増幅する必要はありません。このアッセイは完全にハイブリダイゼーションに依存しています。酵素はハイブリダイゼーションの程度を示すために使用されますが、核酸を操作するためには使用されません。したがって、逆転写ステップ (RNA の場合) やPCRなしで、少量の核酸を検出および定量できます。このアッセイは、労働集約的で多数のサンプルで実行するのが困難な定量ノーザンブロッティングや RNase 保護アッセイとは異なり、ハイスループットアッセイとして実行できます。特定の RNA 分子の定量に用いられる他の主要なハイスループット技術は、 RNAからcDNAへの逆転写後に行われる定量 PCRです。

出発物質が前増幅されていないにもかかわらず、第三世代bDNA検査（1997年）では、血液1mLあたり100コピー未満のHIV-RNAしか検出できない。[ 2 ] 2006年時点で、HIVとHCVのウイルス量を測定するFDA承認の唯一の方法は、当時最新の第三世代bDNAを含むbDNAに基づいていた。[ 4 ]その後、少なくともオランダでは、HBVウイルス量の測定にも承認された。[ 5 ]

ディアカルタ社は、（少なくとも）第三世代bDNAを「isobDNA」として販売しています。これは、HPV E6 / E7がん遺伝子mRNA、放射線療法による損傷を示す循環遊離DNAの検出、[ 6 ]、さらには便潜血検査のOTC検査にも承認されています。[ 7 ]

2021年にNature Scientific Reportsに掲載された論文では、進行癌の治療における化学療法の有効性の予測因子としてcfDNAのレベルを使用し、微量に存在するcfDNAのシグナルを増幅するために分岐DNAアプローチを使用しています。[ 8 ]

参照

注釈と参考文献

  1. ^ Ariffin, Siti Noor Fathilah Ahmad (2013). 「分岐DNA：骨研究における分子診断のための新技術」医学研究最新情報 (RUMeS) . 1 (1): 27–29 .
  2. ^ a b c d e Collins, ML; Irvine, B.; Tyner, D.; Fine, E.; Zayati, C.; Chang, C.; Horn, T.; Ahle, D.; Detmer, J.; Shen, LP; Kolberg, J.; Bushnell, S.; Urdea, MS; Ho, DD (1997). 「100分子/ml未満の核酸標的の定量のための分岐DNAシグナル増幅アッセイ」 . Nucleic Acids Research . 25 (15): 2979– 2984. doi : 10.1093/nar/25.15.2979 . PMC 146852. PMID 9224596 .  
  3. ^ a b Zheng, Minxue; Ahle, David; Warner, Brian; Wu, Ming; Chang, Chu-An (2007年10月17日). 「核酸アッセイにおける高度に直交したユニバーサル配列」 .
  4. ^ a b Tsongalis, Gregory J. (2006年9月). 「分子診断における分岐DNA技術」. American Journal of Clinical Pathology . 126 (3): 448– 453. doi : 10.1309/90BU6KDXANFLN4RJ .
  5. ^ a b「VERSANT HBV bDNAアッセイ」 www.siemens-healthineers.com （オランダ語）。
  6. ^ 「ターゲットbDNAシグナル増幅技術」DiaCarta社
  7. ^ 「DiaCarta、ColoScape検査を補完する家庭用便潜血検査を発売」 BioSpace 、 2023年12月5日。
  8. ^ Zhou, Xiaorong; Li, Chenchen; Zhang, Zhao; Li, Daniel Y.; Du, Jinwei; Ding, Ping; Meng, Haiyan; Xu, Hui; Li, Ronglei; Ho, Effie; Zhang, Aiguo (2021-04-07). 「血漿cfDNAの動態は非小細胞肺がん患者の臨床反応を予測する」 . Scientific Reports . 11 (1): 7633. Bibcode : 2021NatSR..11.7633Z . doi : 10.1038/s41598-021-85797- z . ISSN 2045-2322 . PMC 8027214. PMID 33828112 .   
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