明瞭さ
生物組織を透明化する方法

CLARITY [1]は、アクリルアミドベースのハイドロゲルを組織内部から構築し、組織に結合させることで組織を透明化する手法であり、最初の論文で定義されているように、「特定の成分を新しいアクセシビリティまたは機能性を提供する外因性要素に置き換えたハイブリッド形態への、無傷の生物学的組織の変換」を意味します。 [1]抗体または遺伝子ベースの標識と組み合わせることで、CLARITYは臓器、特に脳のタンパク質および核酸構造の非常に詳細な画像を可能にします。これは、スタンフォード大学医学部のKwanghun ChungとKarl Deisserothによって開発されました。[2]

CLARITY法は、ヒト乳がんの免疫腫瘍学、[3] アルツハイマー病のヒト脳、[4]マウス脊髄、[5] 多発性硬化症の動物モデル、[6]植物など、幅広い組織や疾患状態に適用された論文がいくつか発表されています。[7] CLARITYは、共焦点拡張顕微鏡、SPIM光シート顕微鏡、CLARITY最適化光シート顕微鏡（COLM）などの新しい顕微鏡法の開発にも他の技術と組み合わせられています。[8]

手順

CLARITY法を用いて撮影したマウス海馬の1mm切片を示す3次元画像。異なる色は蛍光抗体で染色されたタンパク質を表す。興奮性ニューロンは緑、抑制性ニューロンは赤、アストロサイトは青で標識されている。

CLARITYイメージングの適用プロセスは、死後組織サンプルから始まります。組織の種類によっては、サンプルを固定した後、脱灰や脱色などの前処理手順が必要になる場合があります。次に、一連の化学処理を施して透明性を実現する必要があります。これにより、サンプルの脂質成分が除去されますが、元のタンパク質と核酸はほぼすべて残ります。[1]その目的は、組織を透明にして、その構成機能部分（主にタンパク質と核酸）の詳細な顕微鏡検査を可能にすることです。これを実現するには、既存のタンパク質構造を透明な足場の中に置き、脂質成分を除去しながらそれを保存する必要があり、この「足場」はアクリルアミドなどのハイドロゲルモノマーでできています。ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの分子を添加すると、保存するタンパク質や核酸への足場の付着が容易になり、細胞成分とアクリルアミドの間の実際の結合を確立するには熱を加えることが必要である。[9]

このステップが完了すると、標的組織細胞のタンパク質と核酸成分はしっかりと固定され、脂質成分は分離したままになります。脂質はその後、洗剤中で受動拡散により数日から数週間かけて除去されるか、電気泳動法によって数時間から数日に加速されます。[10] [11]電気泳動法による加速化の試みは、組織損傷を引き起こさないという点では依然として結論が出ていません。洗剤が通過する際に、その親油性により、途中で遭遇した脂質を吸着して除去することができます。DiIなどの親油性色素は除去されますが、CLARITYと互換性のある親油性色素は、隣接するタンパク質に固定することができます。[12]タンパク質やDNAなどの非脂質分子の大部分は、アクリルアミドゲルと関連する分子の化学的性質のおかげで、この手順の影響を受けません。[9]

最初の論文で報告されているように、このプロセス中に組織は膨張しますが、必要に応じて屈折率マッチング溶液中での最終段階の培養により、元の寸法に戻すことができます。[1]脳は脂質が豊富なため、組織膨張は確かに起こりますが、他の組織タイプでは、このプロセスを通してそれほど大きな組織膨張は起こらないことが知られています。

この段階では、サンプルはイメージングの準備が完全に整っています。イメージングのためのコントラストは、内因性蛍光分子、核酸（DNAまたはRNA）標識、あるいは特定の標的物質に特異的に結合する抗体を用いた免疫染色によって得られます。さらに、これらの抗体は、最終的なイメージング結果の鍵となる蛍光タグで標識されます。標準的な共焦点イメージング法、二光子イメージング法、または光シートイメージング法は、タンパク質の局在レベルまで蛍光を検出するのに適しており、CLARITYが生成する非常に詳細な3次元画像が得られます。[9]

サンプルを免疫染色して画像を取得した後、抗体を除去して新しい抗体を再適用することができるため、サンプルを複数回画像化し、複数のタンパク質タイプをターゲットにすることが可能になります。[13] [14]

アプリケーション

脳イメージングの点では、CLARITYイメージングが特定の構造を非常に詳細に明らかにする能力は、局所的な回路配線（特にコネクトームプロジェクトに関連して）、神経細胞間の関係、細胞内構造の役割、タンパク質複合体のより深い理解、核酸と神経伝達物質のイメージングを含む将来の有望な応用の道を開いています。[1] CLARITYイメージングによる発見の一例としては、ニューロンが自分自身と隣のニューロンに接続する独特の「はしご」パターンがあり、これは動物において自閉症のような行動に関連していることが観察されています。[15]

CLARITY技術は、脳以外にも様々な応用分野に拡大しています。[16]初期の論文を基に数多くの改良が発表されており、学術界とバイオテクノロジー業界の両方において、CLARITYを幅広い用途に適用するための取り組みが行われています。CLARITYは、将来の臨床診断に強力な知見をもたらす可能性のある新興技術として、注目を集め続けています。CLARITYは、肝臓、膵臓、脾臓、精巣、卵巣などの他のほとんどの臓器や、ゼブラフィッシュなどの他の生物種にも、ほとんど、あるいは全く改良を加えることなく使用することができます。骨の除去には簡単な脱灰処理が必要ですが、同様に植物組織は細胞壁の酵素分解が必要です。[10]

NIHのフランシス・コリンズ所長はすでにこの新興技術への期待を表明しており、次のように述べている。[17]

「CLARITYは強力です。研究者は、全体的な視点を失うことなく、病変や損傷を受けた構造に焦点を当て、神経疾患や障害を研究できるようになります。これは、これまで3次元では実現できなかったことです。」

— フランシス・コリンズ

制限事項

CLARITY法は脂質抽出後のタンパク質保持において前例のないレベルを達成しましたが、それでも洗剤電気泳動1回あたり約8%のタンパク質が失われると推定されています。[13]抗体除去は通常、元のサンプルを作成するのと同じ洗剤プロセスによって行われるため、単一サンプルを繰り返し画像化すると、この損失はさらに増大するでしょう。[9]しかし、これらの計算では、実験全体にわたるタンパク質損失を一貫して計算する方法が欠けているようです。Karl Deisseroth氏が設立したClearLight Biotechnologies社は、当初抗体除去のために発表された洗剤プロセスが理想的なアプローチではないことを発見し、組織の完全性にそれほど悪影響を与えない脱色液を開発しました。

この技術のその他の潜在的な欠点としては、サンプルを作成して画像化するのにかかる時間の長さ (免疫組織化学染色だけで実行に最大 6 週間かかります)、および使用されるアクリルアミドが毒性が強く発がん性があるという事実が挙げられます。時間は、CLARITY 技術を使用する上での制限要因および欠点としてしばしば挙げられますが、いくつかの学術企業およびバイオテクノロジー企業 (Logos Bioscience、ClearLight Biotechnologies) は、免疫染色の時間枠を大幅に短縮する CLARITY 試薬の開発と最適化を続けており、サンプルの種類に応じてプロセスを 6 週間から 1 週間にまで短縮しています。すべての組織の透明化には独自の安全性の問題があります。アクリルアミドは毒性があり発がん性があると考えられていますが、その成分はウエスタンブロットに使用されるゲルに含まれるものと似ています。

参照

参考文献

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