クロモジェニックin situハイブリダイゼーション

クロモジェニックin situハイブリダイゼーション( CISH ) は、免疫組織化学 (IHC)技術のクロモジェニック信号検出法とin situハイブリダイゼーションを組み合わせた細胞遺伝学的手法です。[1] [2]これは、HER-2/neuがん遺伝子増幅の検出を目的とした蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)の代替法として、2000 年頃に開発されました。[1] CISH は、DNA の特定領域の有無を検出するために使用されるin situハイブリダイゼーション手法であるという点で、FISH と似ています。 [1]ただし、CISH は、FISH で使用されるより高価で複雑な蛍光顕微鏡ではなく、明視野顕微鏡を使用するため、診断研究室でははるかに実用的です。[1] [3]

手順

クロモジェニックin situハイブリダイゼーションの実施手順

プローブ設計

CISHのプローブ設計はFISHのものと非常に類似しており、標識と検出方法のみが異なります。FISHプローブは一般的に様々な蛍光タグで標識されており、蛍光顕微鏡下でのみ検出可能です[4]。一方、CISHプローブはビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されており[5]、他の処理ステップを適用することで明視野顕微鏡で検出可能です[1] 。

CISHプローブは約20ヌクレオチドの長さで、DNA標的用に設計されています。これらは標的配列に相補的であり、変性およびハイブリダイゼーションのステップの後に結合します。市販されているCISHプローブはごくわずかであるため、ほとんどの用途では、細菌人工染色体（BAC）から抽出、増幅、配列決定、標識付け、マッピングする必要があります。[6] BACは、ヒトゲノムプロジェクト中に、配列決定のためにヒトDNAの短い断片を単離および増幅する必要があったため開発されました。[7]現在では、 UCSCゲノムブラウザなどの公開データベースを使用して、BACを選択し、ヒトゲノム上に配置できます。[6]これにより、最適な相補性と配列特異性が保証されます。BACクローンからDNAを抽出し、縮重オリゴヌクレオチドプライミング（DOP）-PCRなどのポリメラーゼベースの技術を使用して増幅します。[8]次に、クローンの配列を決定し、ゲノム上の位置を確認します。[9]プローブの標識はランダムプライミングまたはニックトランスレーションを使用してビオチンまたはジゴキシゲニンを組み込むことによって行うことができる。[10]

組織の調製、プローブのハイブリダイゼーション、検出

CISHが最適に機能するためには、染色体が間期または中期のいずれかにある必要がある。組織サンプルは、通常スライドガラスである表面にパラフィンでしっかりと固定される。[11]次に、ハイブリダイゼーションステップの前に、組織サンプルを数回洗浄して加熱し、パラフィンを除去する必要がある。この後、サンプルはペプシン消化されて、ターゲットにアクセスできるようになる。[11]最終ステップとして、10～20 μLのプローブを加え、サンプルをゴム糊で密封したカバーガラスで覆い、スライドを97 °Cで5～10分間加熱してDNAを変性させる。[11]次に、プローブがハイブリダイズできるように、スライドを37 °Cのオーブンに一晩置く。[11] [12]翌日、サンプルを洗浄し、非特異的タンパク質結合部位のブロッカーを適用する。[11]西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を使用する場合は、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制するために、サンプルを過酸化水素中でインキュベートする必要があります。 [11]ジゴキシゲニンをプローブラベルとして使用した場合、抗ジゴキシゲニンフルオレセイン一次抗体に続いてHRP結合抗フルオレセイン二次抗体が適用されます。[1]ビオチンをプローブラベルとして使用した場合、非特異的結合部位は最初にウシ血清アルブミン（BSA）を使用してブロックする必要があります。[11]次に、HRP結合ストレプトアビジンを使用して検出します。[6] [11]次に、HRPはジアミノベンジジン（DAB）を不溶性の茶色の生成物に変換します。これは、明視野顕微鏡で40～60倍の倍率で検出できます。[11] [13]ヘマトキシリンで軽く染色して対比染色として使用し、生成物をより見やすくすることができます。[5]

他の技術との比較

A) 直接FISH検出。蛍光標識がプローブに付加され、標的DNA鎖にハイブリダイズします。B) 間接FISH検出。例えば、ビオチンがプローブに付加されます。蛍光標識に結合したストレプトアビジンは、ビオチンに高い特異性で結合します。C) 間接CISH検出。ここでも、ビオチンがプローブに付加されます。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンは、ビオチンに高い特異性で結合します。西洋ワサビペルオキシダーゼは、ジアミノベンジジンを茶色の沈殿物に変換します。

FISHと比較して

FISHは非常に感度が高く、解像度が高いため、染色体異常の検出におけるゴールドスタンダードと考えられています。[3] [14]染色体異常を検出するために開発された他の技術は通常、FISHの感度と特異度と比較され、それらの測定結果が調べられます。[3] [14]たとえば、FISHと比較して、CISHはHER-2 / neu遺伝子増幅の検出に対して97.5％の感度と94％の特異度を示しています。[3] FISHとCISHの一致率は94.8％であり、CISHはFISHに匹敵する技術であることを示しています。[3]他のほとんどの情報源もこれに同意し、FISHとCISHの遺伝子増幅アッセイではほぼ同等の性能が報告されています。[15] [16]ただし、CISHは低レベルの増幅に対して感度が低くなる場合があります。[1]

CISHは、使用する試薬や機器の点でFISHに比べていくつかの利点があります。前述のように、CISHは蛍光顕微鏡ではなく明視野顕微鏡を使用するため、はるかに安価で使いやすいです。[1] [3]さらに、CISH試薬はFISH試薬よりも安定しているため、サンプルを保存して同じサンプルを複数回検査することができます。[3] [14] FISH試薬は光退色により時間の経過とともに退色するため、サンプルは一度しか検査できません。[3] [14]高価な蛍光顕微鏡に加えて、FISHでは蛍光が退色する前にサンプルの顕微鏡写真を撮影するために高解像度のデジタルカメラも必要です。[14]明視野顕微鏡を使用するもう1つの利点は、FISHの蛍光顕微鏡では細胞形態を評価するのが難しいのに対し、CISHでは組織または細胞サンプル全体を視覚化できることです。[3] [14]

CISHは、使用されるプローブだけでなく、全体的な方法においてもFISHとは異なります。FISHプローブには、リピートプローブ、特定の遺伝子またはテロメアを検出するプローブ、染色体異常を検出するプローブなど、多くの種類があります。[14]一方、市販されているCISHプローブの種類は限られており、3、7、8、9、10、11、17、18、X、Y染色体のセントロメアに結合するプローブや、HER-2、EGFR、MYC、TOP2Aなどの癌関連遺伝子に対する遺伝子特異的プローブなどがあります。[14]入手可能なCISHプローブの種類は限られていますが、一般的にFISHプローブよりも費用対効果が高いです。[14]全体的な方法に関して言えば、FISHは直接標識（プローブに蛍光色素を付着させる）または間接標識（プローブをビオチンまたはジゴキシゲニンで標識し、それぞれ蛍光標識ストレプトアビジンまたは抗体を用いて検出する）を使用して行うことができる。[14] CISHは間接標識を使用して行われ、抗体またはストレプトアビジンはHRPやアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素に結合される。[14]

IHCと比較して

CISHとIHCは、どちらも同じ目的（主にHER-2/neu増幅の検出）で使用され、増幅を測定するために酵素反応（HRP/AP）を使用するという点で類似しています。[13] CISHとIHCの違いは、IHCがタンパク質発現を測定するのに対し、CISHはDNA増幅を測定するという点です。[13]この違いは、遺伝子増幅がタンパク質発現よりも高い予後価値を持つことが判明しているため、HER-2/neuの場合に特に有用です。[17]

IHCの欠点は、偽陰性や偽陽性の結果を識別できないことです。[17] CISHでは、参照プローブにシグナルがない場合、アッセイは失敗となります。

低タンパク質過剰発現/遺伝子増幅および高タンパク質過剰発現/遺伝子増幅の場合、CISHとIHCはそれぞれ86%以上、89%以上の一致率を示しています。[18]モノクローナル抗体はポリクローナル抗体よりもIHCとCISHの両方で検出に優れていることが示されています。これは、モノクローナル抗体がより特異的に結合するため、一致率が高くなるためです。[18]

中程度のタンパク質過剰発現/遺伝子増幅の一致率は変動しますが、モノクローナル抗体を使用した場合の方がポリクローナル抗体を使用した場合よりも一致率は高くなります。[18]一致率が変動するのは、遺伝子増幅がタンパク質発現と厳密に相関しておらず、腫瘍の異質性により組織内のタンパク質過剰発現の検出が困難になる可能性があるためです。[18]

医療用途

CISHは、乳がん検体におけるHER-2/neuの状態などの遺伝子増幅の評価に頻繁に適用されています。[2] [19] HER-2/neu増幅は、乳がんにおける死亡率の上昇、再発率の上昇、および予後不良と関連しています。[20]モノクローナル抗体トラスツズマブは、HER-2/neu過剰発現腫瘍に対して臨床的に非常に効果的であることが証明されている受容体阻害剤です。[21]したがって、癌治療を開始する前に受容体の状態を決定することが重要です。[21]

CISHは、肺癌におけるALKチロシンキナーゼドメインとEML4のプロモーターおよび5'領域との融合など、染色体再編成や融合の検出にも用いられます。ALK陽性腫瘍は、ALK阻害剤クリゾチニブによる治療効果が高いため、臨床的に重要なサブグループです。[22] [23]

癌以外にも、CISHはヒトパピローマウイルス感染の検出にも有用であることが示されています。[24]

バリエーション

銀強化現場ハイブリダイゼーション（SISH）

SISHはCISHと同様の方法を用いるが、最終生成物は茶色の生成物ではなく銀沈殿物である。[25]この方法では、ジニトロフェノール（DNP）で標識されたプローブが標的配列に結合します。[25]次に、一次抗DNP抗体を添加し、続いてHRP結合二次抗体を添加します。[25]続いて、酢酸銀、ヒドロキノン、過酸化水素を二次抗体に添加し、HRPは過酸化水素存在下で銀の重合を触媒します。[25]その結果、銀金属が細胞の核に沈着します。[25] HER-2/neuの増幅は黒い点として見られます。[25]

デュオシッシュ

DuoCISHはCISHのバリエーションであり、同じスライド上に2つの異なるプローブが必要であるというニーズに応えます。[26]これは、HER-2/neu増幅検出のための確立された技術ですが、FISHよりも効果が低いという報告もあります。[27]この技術では、1つのプローブが参照（HER-2/neu増幅検出の場合はCEN17（17番染色体のセントロメア））に結合し、もう1つのプローブは標的配列（HER-2/neu）に結合します。[26] [27] DuoCISHは、FISHプローブからの信号を発色基質に変換するという点で、FISHとCISHの両方を兼ね備えています。[26] [27]これは、青色シアニン色素がHRPの基質であり、赤色色素がAPの基質であるという原理で機能します。例えば、緑色のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）シグナルは、HRPに結合した抗FITC抗体を介して青色の発色沈殿物に変換され、テキサスレッドシグナルはAPに結合した抗テキサスレッド抗体を介して赤色の発色沈殿物に変換されます。[26] [27] DuoCISHの利点は、染色体異数性と遺伝子増幅を区別できることです。これは、参照遺伝子も異数性では増幅されますが、遺伝子増幅検出では増幅されないためです。[26] [27]

参考文献

  1. ^ abcdefgh Tanner, M; Gancberg, D; Di Leo, A; Larsimont, D; Rouas, G; Piccart, MJ; Isola, J (2000). 「クロモジェニックin situハイブリダイゼーション：乳がんアーカイブ検体におけるHER-2/neuがん遺伝子増幅検出のための蛍光in situハイブリダイゼーションの実用的な代替法」アメリカ病理学誌. 157 (5): 1467–72 . doi :10.1016/S0002-9440(10)64785-2. PMC  1885742. PMID  11073807 .
  2. ^ ab Madrid, MA; Lo, RW (2004). 「クロモジェニックin situハイブリダイゼーション（FISH）：乳がん組織サンプルにおけるHER-2/neu発現スクリーニングの新たな代替法」. Breast Cancer Research . 6 (5): R593–600. doi : 10.1186/bcr915 . PMC 549176. PMID  15318940 . 
  3. ^ abcdefghi Sáez, A; Andreu, FJ; Seguí, MA; Baré, ML; Fernández, S; Dinarés, C; Rey, M (2006). 「乳がんにおけるHER-2遺伝子増幅（CISH法）と蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH法）の比較 - 200症例の研究」The Breast . 15 (4): 519–27 . doi :10.1016/j.breast.2005.09.008. PMID  16290155.
  4. ^ Garimberti, E; Tosi, S (2010). 「蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の基本原理と方法論」.蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH） . Methods in Molecular Biology. Vol. 659. pp.  3– 20. doi :10.1007/978-1-60761-789-1_1. ISBN 978-1-60761-788-4. PMID  20809300。
  5. ^ ab Lambros, MB; Simpson, PT; Jones, C; Natrajan, R; Westbury, C; Steele, D; Savage, K; MacKay, A; Schmitt, FC; Ashworth, A; Reis-Filho, JS (2006). 「分子遺伝学研究のための病理アーカイブの解明：発色法および蛍光法によるin situハイブリダイゼーション用プローブの信頼性の高い生成法」. Laboratory Investigation . 86 (4): 398– 408. doi : 10.1038/labinvest.3700390 . PMID  16446704.
  6. ^ abc Summersgill, BM; Shipley, JM (2010). 「ホルマリン固定パラフィン包埋組織（組織マイクロアレイを含む）の蛍光in situハイブリダイゼーション解析」.蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH） . Methods in Molecular Biology. Vol. 659. pp.  51– 70. doi :10.1007/978-1-60761-789-1_4. ISBN 978-1-60761-788-4. PMID  20809303。
  7. ^ Shizuya, H; Kouros-Mehr, H (2001). 「細菌人工染色体クローニングシステムの開発と応用」.慶応義塾医学雑誌. 50 (1): 26– 30. doi : 10.2302/kjm.50.26 . PMID  11296661.
  8. ^ Darouich, S; Popovici, C; Missirian, C; Moncla, A (2012). 「FISH法におけるBAC DNAの増幅と標識のためのDOP-PCRの使用」Biotechnic & Histochemistry . 87 (2): 117–21 . doi :10.3109/10520295.2011.559175. PMID  21314248. S2CID  1326145.
  9. ^ De Braekeleer, E; Douet-Guilbert, N; Basinko, A; Morel, F; Le Bris, MJ; Férec, C; De Braekeleer, M (2011). 「白血病研究における細菌人工染色体の利用：フランス・ブレストの大学細胞遺伝学研究所での経験」Journal of Biomedicine and Biotechnology . 2011 : 1– 7. doi : 10.1155/2011/329471 . PMC 3025366 . PMID  21274439. 
  10. ^ Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012)「ニックトランスレーションによるDNAプローブの標識」分子クローニング：実験マニュアル。
  11. ^ abcdefghi Park, K; Kim, J; Lim, S; Han, S; Lee, JY (2003). 「組織マイクロアレイを用いた原発性乳癌におけるHER2/neu状態の判定における蛍光in situハイブリダイゼーション法と発色in situハイブリダイゼーション法の比較」Modern Pathology . 16 (9): 937–43 . doi : 10.1097/01.MP.0000086487.78558.7D . PMID  13679458.
  12. ^ Schildhaus, HU; Deml, KF; Schmitz, K; Meiboom, M; Binot, E; Hauke, S; Merkelbach-Bruse, S; Büttner, R (2013). 「クロモジェニックin situハイブリダイゼーションは、肺腺癌におけるALK再構成の検出において信頼性の高いアッセイである」. Modern Pathology . 26 (11): 1468–77 . doi : 10.1038/modpathol.2013.95 . PMID  23743932.
  13. ^ abc Gupta, D; Middleton, LP; Whitaker, MJ; Abrams, J (2003). 「乳がんにおけるHER-2/neuがん遺伝子の検出における蛍光in situハイブリダイゼーションと発色in situハイブリダイゼーションの比較」American Journal of Clinical Pathology . 119 (3​​): 381–7 . doi : 10.1309/P40P2EAD42PUKDMG . PMID  12645340.
  14. ^ abcdefghijk Lambros, MB; Natrajan, R; Reis-Filho, JS (2007). 「乳がんにおけるクロモジェニック法および蛍光in situハイブリダイゼーション」. Human Pathology . 38 (8): 1105–22 . doi :10.1016/j.humpath.2007.04.011. PMID  17640550.
  15. ^ Zhao, J; Wu, R; Au, A; Marquez, A; Yu, Y; Shi, Z (2002). 「アーカイブ乳癌におけるクロモジェニックin situハイブリダイゼーション（CISH）によるHER2遺伝子増幅の検出」. Modern Pathology . 15 (6): 657–65 . doi : 10.1038/modpathol.3880582 . PMID  12065780. S2CID  19329525.
  16. ^ Shia, J; Klimstra, DS; Li, AR; Qin, J; Saltz, L; Teruya-Feldstein, J; Akram, M; Chung, KY; Yao, D; Paty, PB; Gerald, W; Chen, B (2005). 「大腸癌における上皮成長因子受容体の発現と遺伝子増幅：免疫組織化学および発色in situハイブリダイゼーション法による研究」. Modern Pathology . 18 (10): 1350–6 . doi : 10.1038/modpathol.3800417 . PMID  15832190.
  17. ^ ab トドロヴィッチ＝ラコヴィッチ、N;ヨバノビッチ、D;ネスコヴィッチ・コンスタンティノヴィッチ、Z;ニコリッチ＝ヴコサブリエヴィッチ、D（2005）。 「乳がんにおける HER-2 状態の評価における免疫組織化学と発色in situハイブリダイゼーションの比較」。パソロジー・インターナショナル。55 (6): 318–23 .土井:10.1111/j.1440-1827.2005.01831.x。PMID  15943788。S2CID 24153338  。
  18. ^ abcd Rosa, FE; Santos, RM; Rogatto, SR; Domingues, MA (2013). 「乳癌におけるHER2/neu状態の評価におけるクロモジェニックin situハイブリダイゼーションと他のアプローチの比較」. Brazilian Journal of Medical and Biological Research . 46 (3): 207–16 . doi :10.1590/1414-431x20132483. PMC 3854374. PMID 23558859  . 
  19. ^ 熊本 秀次; 笹野 秀次; 谷口 剛; 鈴木 剛; 守屋 剛; 市之迫 亮 (2001). 「乳癌におけるHER-2/neu発現のクロモジェニックin situハイブリダイゼーション解析：トラスツズマブ（ハーセプチン）療法のスクリーニングにおける応用」. Pathology International . 51 (8): 579–84 . doi :10.1046/j.1440-1827.2001.01255.x. PMID  11564211. S2CID  21849968.
  20. ^ Mitri, Z; Constantine, T; O'Regan, R (2012). 「乳がんにおけるHER2受容体：病態生理学、臨床応用、そして治療の新たな進歩」. Chemotherapy Research and Practice . 2012 : 1–7 . doi : 10.1155/2012/743193 . PMC 3539433. PMID  23320171 . 
  21. ^ ab Swain, SM; Kim, SB; Cortés, J; Ro, J; Semiglazov, V; Campone, M; Ciruelos, E; Ferrero, JM; Schneeweiss, A; Knott, A; Clark, E; Ross, G; Benyunes, MC; Baselga, J (2013). 「HER2陽性転移性乳がんに対するペルツズマブ、トラスツズマブ、ドセタキセル（CLEOPATRA試験）：ランダム化二重盲検プラセボ対照第3相試験の全生存率結果」The Lancet Oncology . 14 (6): 461– 71. doi :10.1016/S1470-2045(13)70130-X. PMC 4076842. PMID  23602601 . 
  22. ^ Kwak, EL; Bang, YJ; Camidge, DR; Shaw, AT; Solomon, B; Maki, RG; Ou, SH; Dezube, BJ; Jänne, PA; Costa, DB; Varella-Garcia, M; Kim, WH; Lynch, TJ; Fidias, P; Stubbs, H; Engelman, JA; Sequist, LV; Tan, W; Gandhi, L; Mino-Kenudson, M; Wei, GC; Shreeve, SM; Ratain, MJ; Settleman, J; Christensen, JG; Haber, DA; Wilner, K; Salgia, R; Shapiro, GI; et al. (2010). 「非小細胞肺がんにおける未分化リンパ腫キナーゼ阻害」. New England Journal of Medicine . 363 (18): 1693–703 . doi :10.1056/NEJMoa1006448. PMC 3014291. PMID 20979469  . 
  23. ^ Wagner, F; Streubel, A; Roth, A; Stephan-Falkenau, S; Mairinger, T (2014). 「クロモジェニックin situハイブリダイゼーション（CISH）はALK陽性非小細胞肺癌の検出に強力な方法である」. Journal of Clinical Pathology . 67 (5): 403–7 . doi :10.1136/jclinpath-2013-201974. PMID  24293609. S2CID  25718718.
  24. ^ Zappacosta, R; Colasante, A; Viola, P; d'Antuono, T; Lattanzio, G; Capanna, S; Gatta, DM; Rosini, S (2013). 「ホルマリン固定パラフィン包埋子宮頸部標本におけるクロモジェニックin situハイブリダイゼーションおよびp16/Ki67二重染色：HPV-DNA検査、E6/E7 mRNA検査との相関、そして潜在的な臨床応用」BioMed Research International . 2013 : 1– 11. doi : 10.1155/2013/453606 . PMC 3858005. PMID  24369532 . 
  25. ^ abcdef Shousha, S; Peston, D; Amo-Takyi, B; Morgan, M; Jasani, B (2009). 「乳癌切除標本およびコア生検標本におけるHER2遺伝子増幅検出のための自動銀増強in situハイブリダイゼーション（SISH）の評価」Histopathology . 54 (2): 248–53 . doi :10.1111/j.1365-2559.2008.03185.x. PMID  19207950. S2CID  31938310.
  26. ^ abcde Henriksen, U., Müller, S., Schønau, A. (2009) 第14章「デュアルカラーCISHおよびFISHからCISHへの変換」、GL KumarおよびL. Rudbeck（編）『免疫組織化学（IHC）染色法 第5版』 97～101頁、カリフォルニア州カーピンテリア：Dako North America
  27. ^ abcde Mollerup, J; Henriksen, U; Müller, S; Schønau, A (2012). 「乳がんにおけるHER2発現状況の判定のためのデュアルカラークロモジェニックin situハイブリダイゼーション：最新の蛍光in situハイブリダイゼーションとの大規模比較研究」BMC Clinical Pathology . 12 : 3. doi : 10.1186/1472-6890-12-3 . PMC 3305592 . PMID  22333181. 
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