臨床メタゲノムシーケンシング
Method of analysis of genetic material

臨床メタゲノム次世代シーケンシング（mNGS ）は、患者の臨床検体中の微生物および宿主の遺伝物質（DNAまたはRNA ）を次世代シーケンシングによって包括的に分析する手法です。メタゲノミクス技術を用いて、特定の病原体に関する事前の知識を必要とせずに、臨床検体から直接、細菌、真菌、寄生虫、ウイルスのゲノムを同定し、特徴付けます。検体中の潜在的な病原体をすべて検出できるため、メタゲノム次世代シーケンシングは、特にPCRなどのより標的を絞った分析が失敗した場合に、感染症の診断において強力なツールとなります。その限界としては、臨床的有用性、検査室での妥当性、感覚と感度、コスト、規制上の考慮事項などがあります。[1]

臨床医学以外では、池や土壌などの環境サンプル中の遺伝物質を特定するための同様の研究が行われています。 [2]

意味

次世代シーケンシングは、メタゲノミクスの技術を用いて、特定の病原体に関する事前の知識を必要とせずに、臨床検体から直接、細菌、真菌、寄生虫、ウイルスのゲノムを識別し、特徴づける。 [3]サンプル中の潜在的な病原体をすべて検出できる能力により、メタゲノミクス次世代シーケンシングは、特にPCRなどの他のより標的を絞ったアッセイが失敗した場合に、感染症の診断において強力なツールとなる。[4]

研究室のワークフロー

典型的な mNGS ワークフローは次のステップで構成されます。

  • サンプル採取：メタゲノムシーケンシングに最も一般的に用いられるサンプルは、血液、便、脳脊髄液（CSF）、尿、または鼻咽頭スワブです。これらのうち、血液とCSFは最もクリーンでバックグラウンドノイズが少ないのに対し、その他のサンプルは常在菌や日和見感染が多数存在すると予想され、バックグラウンドノイズが多くなります。[2]手術標本は生検の取り扱い中に汚染される可能性があるため、サンプル採取には細心の注意が必要です。例えば、CSF標本を採取するための腰椎穿刺は、処置中に汚染される可能性があります。[4]
  • RNA/DNA抽出：サンプル中のDNAとRNAは抽出キットを用いて抽出されます。病原体のゲノム構成について事前に強い疑いがある場合、また、ノイズサンプル中の病原体核酸の量が他の生物のRNA/DNAに圧倒されている場合は、RNAまたはDNAのみの抽出キットを選択する方が、より特異的かつ簡便なアプローチとなります。市販されているキットとしては、例えば、RNeasy PowerSoil Total RNAキット（Qiagen）、RNeasy Minikit（Qiagen）、MagMAX Viral Isolation kit（ABI）、Viral RNA Minikit（Qiagen）などがあります。[2]
  • ライブラリ調製の最適化戦略：メタゲノムシーケンシングではバックグラウンドノイズレベルが高いため、病原体由来の転写産物やゲノムを捕捉する確率を高めることを目的としたターゲットエンリッチメント法がいくつか開発されている。一般的に、サンプル中の病原体シグナル量を増加させるために用いられる主なアプローチは、ネガティブセレクションとポジティブエンリッチメントの2つである。[2] [3]
  1. ネガティブ選択（バックグラウンド除去またはサブトラクション）は、宿主およびマイクロバイオームのゲノムバックグラウンドを標的として除去し、対象病原体由来の核酸の保存を目的としています。ゲノムバックグラウンドの分解は、DNAバックグラウンドの場合はDNase Iなどのヌクレアーゼを用いた広域スペクトル消化、または配列特異的RNA除去キットを用いた豊富なRNA種（rRNA、mtRNA、グロビンmRNA）の除去によって行うことができます。また、CRISPR-Cas9ベースのアプローチを用いて、例えばヒトミトコンドリアRNAを標的として除去することも可能です。しかしながら、一般的に、サブトラクションアプローチは、クリーンアップ中に回収率が低下する可能性があるため、標的病原体ゲノムのある程度の損失につながります。[2]
  2. ポジティブエンリッチメントは、バックグラウンドノイズを低減するのではなく、病原体シグナルを増強するために使用されます。これは通常、プローブによるハイブリダイゼーションベースの標的捕捉によって行われ、プローブは下流の増幅およびシーケンシングのために目的の核酸を抽出するために使用されます。パンウイルスプローブは、様々な臨床体液および呼吸器検体中の多様な病原体を同定できることが示されており、新規ウイルスのシーケンシングおよび特性解析に使用されています。しかし、プローブアプローチには追加のハイブリダイゼーションおよびクリーンアップ手順が含まれるため、サンプルインプット量が増加し、標的を見失うリスクが高まり、コストと作業時間が増加します。[2]
  • ハイスループットシーケンス：ライブラリのすべての核酸断片がシーケンスされます。使用するシーケンスプラットフォームは、研究室の研究目的、個人の経験、スキルレベルなど、さまざまな要因に応じて選択されます。これまでのところ、イルミナMiSeqシステムは、感染症研究、病原体サーベイランス、研究および公衆衛生における病原体発見において最も一般的に使用されているプラ​​ットフォームであることが証明されています。この装置は実験台に収まるほどコンパクトで、他の同様のプラットフォームと比較して実行時間が短く、強力なユーザーサポートコミュニティがあります。しかし、この技術のさらなる改良、さらなるエラー削減とソフトウェアの安定化により、MinIONは、特にリソースが限られている小規模な研究室における日常的なサーベイランスのための現在のシーケンス技術の優れた追加機能となる可能性があります。例えば、MinIONは、ブラジルにおける蚊とヒトのジカウイルスのリアルタイムサーベイランスのためのZiBRAプロジェクト、および進行中のエボラ出血熱の流行中のリアルタイムサーベイランスを行うギニアで成功裏に使用されています。[5] [6]一般的に、限られたリソースの場合はIlluminaMiSeq、iSeq、Ion Torrent PGM、Oxford Nanopore、MinIONが用いられます。一方、リソースが豊富な場合はIllumina NextSeq、NovaSeq、PacBio Sequel、Oxford Nanopore、PromethIONが推奨されます。さらに、病原体シーケンシングにおいては、mNGSアッセイの品質と経時的な安定性を確保するために、コントロールの使用が極めて重要です。PhiXはシーケンシングコントロールとして使用され、その他のコントロールには、陽性コントロール、追加の内部コントロール（例：スパイクDNAまたは他の既知の病原体）、および陰性コントロール（通常は水サンプル）が含まれます。[2]
  • バイオインフォマティクス解析：シーケンシング自体は広くアクセス可能になり、ユーザーフレンドリーになった一方で、その後のデータ解析と解釈には、依然として専門的なバイオインフォマティクスの専門知識と適切な計算リソースが必要です。シーケンシングプラットフォームから得られる生データは通常、低品質リードや重複リードを除去するために、クリーニング、トリミング、フィルタリングされます。宿主ゲノム／トランスクリプトームリードの除去は、バックグラウンドノイズ（宿主や環境由来のリードなど）を低減し、病原体リードの頻度を高めるために行われます。このステップは、下流の解析時間も短縮します。さらにバックグラウンドノイズを除去するために、サンプルリードをネガティブコントロールのリードにマッピングすることで、試薬やサンプル保存媒体に由来するリードなどの混入リードを確実に排除します。残りのリードは通常、デノボアセンブルされ、コンティグと呼ばれる長い配列を生成します。得られたコンティグの分類学的同定は、ヌクレオチドまたはタンパク質データベースのゲノムおよび配列と照合することによって行われます。このために、BLASTの様々なバージョンが最も一般的に使用されています。細菌の高度な特性解析も可能であり、遺伝子特性解析結果に必要な深さと幅のカバレッジを得ることができます。遺伝子呼び出しは、RASTや全ゲノム提出時にNCBIサービスを使用するなど、様々な方法で行うことができます。複数のアノテーションツールの結果は、正確性と完全性を比較し、必要に応じてBEACONを使用して統合することができます。抗生物質耐性遺伝子の特性解析には、包括的抗生物質耐性データベース（CARD）の耐性遺伝子識別子が一般的に使用されています。毒性因子遺伝子の特性解析には、ShortBREDは毒性因子データベースからカスタマイズされたデータベースを用いた解析を提供しています。[2]

感染症への応用

これらの病原体を検出する一つの方法は、標的型または非標的型のメタゲノミクスシーケンシング（次世代シーケンシング-mNGS）によってゲノムの一部を検出することである。[3]

ターゲット

そのため、標的の微生物を検出する感度は通常向上しますが、識別可能な病原体の量には制限が伴います。[3]

非標的

非標的解析は、メタゲノムショットガンシーケンシング手法です。この手法では、ユニバーサルプライマーを用いて全DNAおよび／またはRNAをシーケンシングします。得られたmNGSリードは、部分ゲノムまたは完全ゲノムにアセンブルできます。これらのゲノム配列は、院内アウトブレイクのモニタリングを可能にし、感染制御と公衆衛生監視を促進します。また、サブタイピング（微生物の特定の遺伝子変異の同定）にも使用できます。[要出典]

非標的mNGSは、臨床検体を分析し、感染症の包括的な診断を行うための最も有望なアプローチです。様々なグループが、髄膜炎や脳炎、敗血症、肺炎などの臨床検査改善法（CLIA）においてmNGSの有効性を検証しています。[3]この手法は、正確な感染病因が疑われない状況で非常に有用です。[7]例えば、肺炎が疑われる患者において、COVID-19のように根本的な感染病因を特定することは、臨床的にも公衆衛生的にも重要な意味を持ちます。[8] [7]

従来の診断法は、患者の病歴、臨床所見、画像所見、臨床検査に基づいて鑑別診断を立案するものです。しかし、ここでは異なる診断法が提案されています。メタゲノム次世代シーケンシング（NGS）は、単一の検査で潜在的な原因（ウイルス、細菌、真菌、寄生虫）の包括的なスペクトルを特定できるため、有望な方法です。[3]

以下は感染症診断におけるメタゲノム配列解析の応用例です。[要出典]

例

髄膜炎および脳炎の診断

感染症の診断に用いられる従来の方法は、神経炎症性疾患、希少病原体に対する診断検査の不足、そして侵襲的処置を必要とするため中枢神経系（CNS）サンプルの入手と量に限界があることなど、いくつかのケースで課題を抱えています。これらの問題から、メタゲノム次世代シーケンシング（NGS）という異なる診断方法が提案されています。要約すると、NGSは1回の検査で幅広い病原体を特定することができます。[9]

いくつかの研究では、従来の微生物学的検査と並行して、メタゲノムNGSによる神経感染症の診断における臨床的有用性を評価しています。髄液（CSF）のメタゲノムNGSと、血清学的検査や髄液以外の検体を用いた検査を含む従来の検査を組み合わせた場合に、最も高い診断率が得られることが分かっています。[9]従来の検査を行っても、一部の患者では神経感染症が未診断のままとなることがあります。[9]

メタゲノムNGSの結果は、従来の検査結果と一致する場合でも価値があり、従来の診断が正しいという安心感を与えるだけでなく、特に免疫不全患者における重複感染を検出または除外する可能性もあります。[9]

抗菌薬耐性に関する研究

現在、様々な微生物の耐性を検出するために抗生物質感受性（AST）と呼ばれる手法が用いられていますが、いくつかの研究により、細菌の耐性はゲノム中に存在し、水平伝播（HGT）によって伝播することが明らかになっています。そのため、これらのゲノムおよびメタゲノムの同定と特性解析を容易にするためのシーケンシング法が開発されています。現在、抗菌薬耐性を検出するには以下の方法があります。[10]

  • 抗生物質感受性：この方法の利点は、患者の治療に役立つ情報が得られることです。一方で、いくつかの欠点もあり、その一つは、この技術は培養可能な細菌にしか有効ではなく、その検査には熟練した検査員が必要となることです。[10]
  • シーケンシング法：これらの方法はAST法に比べて迅速で合理的であること、人工培地で増殖する細菌とそうでない細菌の両方に有効であること、そして複数の生物種を比較研究できることなどが利点です。サンプルの種類に応じて、あるタイプのシーケンシング法を他のタイプよりも優先して使用できます。ゲノムサンプルの場合はアセンブリベースの方法が使用され、メタゲノムサンプルの場合はリードベースの方法が適しています。[10]

メタゲノムシーケンシング法は、ゲノミクスよりも偽陰性が少ないため、優れた結果をもたらしています。メタゲノムシーケンシングにおいて、機能メタゲノムはレジストーム（耐性遺伝子）の特性評価に強力なアプローチです。サンプルから抽出した全コミュニティDNAを発現ベクターにクローニングすることでメタゲノムライブラリを作成し、このライブラリを野生型宿主に対して致死的な選択培地に播種することで抗菌薬耐性を検査します。その後、生存する組換え抗菌薬耐性宿主細胞から選択されたインサートをシーケンシングし、得られた配列をアセンブルしてアノテーション（PARFuMS）します。[10] [11]

機能メタゲノミクスにより、いくつかの新しい抗菌薬耐性メカニズムと関連遺伝子の発見が可能になりました。その一例は、最近発見されたテトラサイクリンデストラクチャーゼによるテトラサイクリン耐性メカニズムです。[10]抗菌薬耐性遺伝子の配列とメカニズムだけでなく、ゲノムのコンテキスト、宿主細菌種、地理的位置（メタゲノム）も考慮することが重要です。[10]

パンデミックへの備え

エボラウイルスやコロナウイルスなどの潜在的に危険な病原体、そして未知の病原体の最も近い遺伝的近縁種を即座に特定し、更なる追跡調査を促すことができる。パンデミック対策における今後の役割が期待されており、未知の病原体の発生を検知し、適切な対応をとるための最も早期の監視システムとなる可能性がある。[12]

臨床マイクロバイオーム解析

mNGSを用いてマイクロバイオームの特性を明らかにすることで、例えばクロストリディオイデス・ディフィシル関連疾患の治療薬として錠剤として投与される細菌性プロバイオティクスの開発が可能になった。[3]

ヒト宿主反応解析

遺伝子発現を研究することで、多くの感染症、例えば黄色ブドウ球菌、ライム病、カンジダ症、結核、インフルエンザなどによる感染症の特徴を明らかにすることができます。また、このアプローチは癌の分類にも応用できます。[要出典]

RNAseq分析には、臨床サンプルから直接、新規または過小評価されている宿主-微生物相互作用を特定すること、病原体特異的なヒト宿主反応に基づいて間接的な診断を行うこと、急性疾患の感染性原因と非感染性原因を区別することなど、他の多くの目的と用途があります。[3]

課題

臨床的有用性

生成されるメタゲノミクスの結果データのほとんどは症例報告で構成されており、診断メタゲノミクスへの関心の高まりを裏付けています。[13]

したがって、メタゲノミクスによる診断は、基本的には症例報告の文脈でのみ有用であり、日常的な診断目的には役立たないため、このアプローチは臨床微生物学研究室に十分に浸透していない。 [13]

2018年時点では、原因不明の発熱の診断におけるメタゲノミクスの費用対効果モデル化により、診断メタゲノミクスのコストを1検査あたり100～1000ドルに制限した後でも、コスト中立になるためには腹部および骨盤のCT検査の2.5～4倍の診断収量が必要であると結論付けられ、メタゲノミクス検査の導入への「広範な駆け込み」に対して警告が発せられました。[13]

さらに、潜在的な新規感染性病原体の発見の場合、シーケンス解析された症例の大多数が陰性であるにもかかわらず、通常は陽性結果のみが公表されるため、非常に偏った情報となる。さらに、診断に基づく研究に先立つメタゲノムに基づく発見研究の大半では、未解決症例のスクリーニングで全く新しい原因が検出された際に検出された既知の病原体についても言及されている。[13]

検査室妥当性

これまでに公表されている検査のほとんどは、検証されておらず、報告も不可能な方法で実施されています。メタゲノミクスの前にサンプルに行われる「標準的な微生物学的検査」はばらつきがあり、一般的な呼吸器系ウイルスに対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）検査や、日常的に行われている16S/ITS PCR検査は含まれていません。[13]

メタゲノムPCR検査と16S/ITS PCR検査の検証と実施にかかる相対的なコストを考慮すると、後者の方がより容易で効率的な選択肢であると考えられます。16S/ITS検査の潜在的な例外は血液です。血液は利用可能な16S配列が膨大であるため、診断目的での明確なカットオフが困難です。[13]

さらに、メタゲノミクスで検出され、関連する治療法があり、真に実用的な微生物のほぼ全ては、16S/ITS検査（または16S/ITS-NGS）でも検出可能である。このため、多くの診断症例においてメタゲノミクスの有用性は疑問視されている。[13]

実験室妥当性を達成するための主要なポイントの一つは、mNGSアッセイを実施する際に参照標準物質とコントロール物質の存在です。これらは、この技術の長期にわたる品質と安定性を確保するために不可欠です。[3]

感覚と感受性

臨床微生物学研究室では、微生物負荷量の定量は疾患の重症度および進行度と関連しているため、日常的な検査とみなされています。良好な定量結果を得るには、高い感度の技術が必要です。[13]

干渉物質は臨床化学やPCR診断において共通の問題であるが、メタゲノミクスにおいては宿主（例えば組織生検）や非病原体核酸（例えば便）からの干渉の程度が新たな問題となっている。[3] [13]さらに、微生物ゲノムと比較したヒトゲノムの相対的な大きさにより、汚染物質の濃度が低くても干渉が発生する可能性がある。[13]

臨床メタゲノミクスの感度に関するもう一つの課題は、高力価病原体が存在する場合の同時感染の診断である。高力価病原体は不均衡に読み取りを吸収し、あまり優勢でない病原体の区別を困難にするため、偏った結果を生み出す可能性がある。[13]

干渉物質の問題に加え、特に診断分野においては、結果の混乱が第三者である患者に影響を与える可能性があるため、正確な定量と感度が不可欠です。そのため、臨床医は現在、イルミナシーケンシングに関連するインデックススワッピングの問題を深く認識する必要があります。インデックススワッピングの問題は、バーコードが誤って付与されたサンプルの検出につながる可能性があります。[13]

メタゲノミクスは、これまで他のすべての検査が陰性であった患者に一般的に用いられてきたため、分析感度に関する疑問はそれほど重要ではありませんでした。しかし、感染症の除外は臨床メタゲノミクスの重要な役割の一つであり、十分な感度を達成するために十分な深さのシーケンシングを実施できることが不可欠です。その一つの方法として、新たなライブラリー調製技術の開発が挙げられます。[13]

コストの考慮

2018年現在、イルミナは高品質の次世代シーケンシング試薬を独占しているため、シーケンシング試薬単体のコストがFDA承認の症候群検査パネルよりも高くなっています。また、抽出、ライブラリー調製、計算解析といったメタゲノミクスの直接的な追加コストも考慮する必要があります。[13]一般的に、メタゲノムシーケンシングは、以下の基準の少なくとも1つを満たす場合に 、病原体発見において最も有用かつ費用対効果の高いものとなります。

  1. 生物の同定だけでは不十分である（発見を超えてゲノム特性評価のためのデータを生成することを望む）
  2. 重複感染が疑われる場合、
  3. 他のより単純な分析は効果がないか、非常に時間がかかります。
  4. 環境サンプルをスクリーニングし、これまで説明されていない病原体や異なる病原体を検出する。[2]

参照

参考文献

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