| DNAリガーゼ | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 DNAリガーゼが染色体の損傷を修復する様子を描いた想像図 | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| EC番号 | 6.5.1.1 | ||||||||
| CAS番号 | 9015-85-4 | ||||||||
| データベース | |||||||||
| インテンズ | IntEnzビュー | ||||||||
| ブレンダ | ブレンダエントリー | ||||||||
| エクスパス | NiceZymeビュー | ||||||||
| ケッグ | KEGGエントリー | ||||||||
| メタサイクル | 代謝経路 | ||||||||
| プリアモス | プロフィール | ||||||||
| PDB構造 | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| 遺伝子オントロジー | アミゴー / クイックゴー | ||||||||
| |||||||||
| リガーゼI、DNA、ATP依存性 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 | |||||||
| 識別子 | |||||||
| シンボル | LIG1 | ||||||
| NCBI遺伝子 | 3978 | ||||||
| HGNC | 6598 | ||||||
| オミム | 126391 | ||||||
| 参照シーケンス | NM_000234 | ||||||
| ユニプロット | P18858 | ||||||
| その他のデータ | |||||||
| 軌跡 | 第19章 [1] | ||||||
| |||||||
| リガーゼIII、DNA、ATP依存性 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 識別子 | |||||||
| シンボル | LIG3 | ||||||
| NCBI遺伝子 | 3980 | ||||||
| HGNC | 6600 | ||||||
| オミム | 600940 | ||||||
| 参照シーケンス | NM_002311 | ||||||
| ユニプロット | P49916 | ||||||
| その他のデータ | |||||||
| 軌跡 | 17章 q11.2-q12 | ||||||
| |||||||
DNAリガーゼは、リン酸ジエステル結合の形成を触媒することでDNA鎖の結合を促進する酵素の一種です。生体内の二本鎖DNAにおける一本鎖切断の修復に役割を果たしますが、 DNAリガーゼIVなどの一部の酵素は二本鎖切断（つまり、DNAの相補鎖の両方の切断）を特異的に修復します。一本鎖切断は、DNAリガーゼが二重らせんの相補鎖を鋳型として用いて修復され、[1] DNAリガーゼが最終的なリン酸ジエステル結合を形成することでDNAが完全に修復されます。
DNAリガーゼは、 DNA修復とDNA複製の両方に使用されます（哺乳類リガーゼを参照）。さらに、DNAリガーゼは分子生物学研究室において組換えDNA実験に広く使用されています（研究用途を参照）。精製されたDNAリガーゼは、遺伝子クローニングにおいてDNA分子を結合させて組換えDNAを形成するために使用されます。
酵素のメカニズム
DNAリガーゼの機構は、一方のヌクレオチド（「アクセプター」）の3'ヒドロキシル末端と、もう一方のヌクレオチド（「ドナー」）の5'リン酸末端との間に、2つの共有リン酸 ジエステル結合を形成することである。形成されるリン酸ジエステル結合1つにつき、2分子のATPが消費される。[要出典]リガーゼ反応にはAMPが必要であり、反応は以下の4段階で進行する。
- DNA セグメントの切れ目や岡崎フラグメントなどの活動部位の再編成。
- 酵素の活性中心のリジン残基のアデニル化（AMP の付加）により、ピロリン酸が放出されます。
- AMP をいわゆるドナーの 5' リン酸に転移し、ピロリン酸結合を形成します。
- ドナーの5'リン酸基とアクセプターの3'ヒドロキシル基との間にリン酸ジエステル結合が形成される。[2]
リガーゼは平滑末端でも機能しますが、より高い酵素濃度と異なる反応条件が必要になります。
種類
大腸菌
大腸菌DNAリガーゼはlig遺伝子によってコードされている。大腸菌のDNAリガーゼは、ほとんどの原核生物と同様に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を切断することで得られるエネルギーを利用してリン酸ジエステル結合を形成する。[3]ポリエチレングリコール による分子密集状態以外では、平滑末端DNAを連結することはできず、RNAをDNAに効率的に結合させることもできない。[要出典]
大腸菌DNAリガーゼの活性は、適切な濃度のDNAポリメラーゼによって増強される。増強は、DNAポリメラーゼ1の濃度が連結されるDNA断片よりもはるかに低い場合にのみ機能する。Pol I DNAポリメラーゼの濃度が高い場合、大腸菌DNAリガーゼに悪影響を与える[4]。
T4
T4バクテリオファージ（大腸菌に感染するバクテリオファージ）由来のDNAリガーゼ。T4リガーゼは研究室で最も一般的に使用されている。[5] DNA、オリゴヌクレオチド、RNA、RNA-DNAハイブリッドの付着末端および平滑末端 を連結することができるが、一本鎖核酸は連結できない。また、大腸菌DNAリガーゼよりもはるかに高い効率で平滑末端DNAを連結することができる。大腸菌DNAリガーゼとは異なり、T4 DNAリガーゼはNADを利用できず、補酵素としてATPを必須とする。T4 DNAリガーゼのin vitro活性を向上させるための改良がいくつか行われている。例えば、ある成功したアプローチでは、T4 DNAリガーゼをいくつかの代替DNA結合タンパク質と融合させて試験し、p50またはNF-κBを融合パートナーとしたコンストラクトは、クローニング目的の平滑末端ライゲーションにおいて、野生型T4 DNAリガーゼよりも160%以上活性が高いことを発見しました。[6] プラスミドベクターに断片を挿入するための典型的な反応では、約0.01ユニット（粘着末端）から1ユニット（平滑末端）のリガーゼを使用します。T4 DNAリガーゼの最適なインキュベーション温度は37℃で、これはT4酵素が最も活性を示す温度です。しかし、リガーゼが活性であると同時に粘着末端の塩基対形成にも適した温度である16℃でライゲーション反応を設定することも珍しくありません。[要出典]
バクテリオファージT4リガーゼの変異体は紫外線照射[7] [8]とアルキル化剤メチルメタンスルホン酸[9]の両方に対する感受性が高まっており、DNAリガーゼがこれらの薬剤によって引き起こされるDNA損傷の修復に利用されていることを示している。
哺乳類
哺乳類には、4 つの特定のタイプのリガーゼが存在します。
- DNA リガーゼ 1 :リボヌクレアーゼ H が岡崎断片から RNA プライマーを除去した後、ラギング鎖の新生 DNA を連結します。
- DNAリガーゼ3：DNA修復タンパク質XRCC1と複合体を形成し、ヌクレオチド除去修復および組み換え断片の修復過程においてDNAの封印を助ける。哺乳類で知られているDNAリガーゼの中で、ミトコンドリアに存在するのはリガーゼ3のみである。
- DNAリガーゼ4 ： XRCC4と複合体を形成します。非相同末端結合によるDNA二本鎖切断修復経路の最終段階を触媒します。また、免疫系の発達過程において免疫グロブリンおよびT細胞受容体遺伝子座の多様性を生み出すプロセスであるV(D)J組換えにも必要です。
- DNAリガーゼ2：DNAリガーゼ3のタンパク質分解によって生じる精製産物。当初は別のDNAリガーゼとして認識されており、これがDNAリガーゼの珍しい命名法の理由である。[10]
真核生物や一部の微生物のDNAリガーゼはNADではなくアデノシン三リン酸（ATP）を使用する。 [3]
耐熱性
この酵素は好熱性細菌由来であり、従来のDNAリガーゼよりもはるかに高い温度でも安定して活性を示します。半減期は65℃で48時間、95℃で1時間以上です。アンプリガーゼDNAリガーゼは、少なくとも500回の熱サイクル（94℃/80℃）または16時間のサイクルにわたって活性を示すことが示されています。 [ 10 ] この優れた熱安定性により、極めて高いハイブリダイゼーションストリンジェンシーとライゲーション特異性が得られます。[11]
活動の測定
DNAリガーゼの活性を測定するために使用される単位は少なくとも3つあります。[12]
- ワイス単位- 37 ° Cで 20 分以内に無機ピロリン酸から ATP への 1 nmole の32 Pの交換を触媒するリガーゼの量。これは最も一般的に使用される単位です。
- Modrich-Lehman 単位- これはめったに使用されませんが、1 単位は標準条件下で 30 分以内に 100 nmole の d(AT) n をエキソヌクレアーゼ III 耐性形態に変換するのに必要な酵素の量として定義されます。
- 多くの市販のリガーゼ供給業者は、リガーゼの付着末端を連結する能力に基づいて任意の単位を使用しています。これらの単位は定量的というより主観的であり、精度に欠ける場合が多いです。
研究アプリケーション
DNAリガーゼは、現代の分子生物学研究において、組み換えDNA配列を生成するための不可欠なツールとなっています。例えば、DNAリガーゼは制限酵素と併用することで、DNA断片（多くの場合、遺伝子）をプラスミドに挿入するために使用されます。
付着末端断片のライゲーションを伴う組換え実験を効率的に行うには、最適温度の制御が極めて重要です。ほとんどの実験では、37 °C で最も活性が高くなるT4 DNA リガーゼ（バクテリオファージ T4から単離）が使用されています。 [13] しかし、付着末端断片（「粘着末端」）のライゲーション効率を最適化するには、最適な酵素温度と、ライゲーションされる粘着末端の融解温度T mとのバランスをとる必要があります。 [14]高温によって水素結合が破壊されるため、粘着末端の相同対合は安定しません。ライゲーション反応は、粘着末端がすでに安定してアニールされているときに最も効率的であり、アニール末端の破壊はライゲーション効率の低下につながります。オーバーハングが短いほど、T mは低くなります。
平滑末端DNA断片にはアニールする付着末端がないため、ライゲーション反応の通常の温度範囲では融解温度は考慮すべき要素ではありません。平滑末端ライゲーションにおける制限因子はリガーゼの活性ではなく、DNA断片末端間のアラインメント数です。したがって、平滑末端DNAの最も効率的なライゲーション温度は、最も多くのアラインメントが起こり得る温度となります。平滑末端ライゲーションの大部分は、14～25℃で一晩行われます。安定的にアニールされた末端が存在しないということは、ライゲーション効率が低下することを意味し、より高いリガーゼ濃度を使用する必要があります。[14]
DNAリガーゼの新たな用途は、ナノ化学、特にDNAオリガミの分野で見られる。DNAを基盤とした自己組織化原理は、生体分子、ナノマシン、ナノエレクトロニクスおよびフォトニックコンポーネントといったナノスケールの物体の組織化に有用であることが証明されている。このようなナノ構造を組み立てるには、DNA分子の複雑な網目構造を形成する必要がある。DNAの自己組織化は、アルミホイルなどの様々な基質を用いることで、外部からの支援なしに可能であるが、DNAリガーゼは、DNAオーバーハングからDNA格子構造を形成するために必要な酵素的支援を提供することができる。[15]
歴史
最初のDNAリガーゼは、1967年にゲラート、レーマン、リチャードソン、ハーウィッツの各研究所によって精製され、特徴づけられました。[16]ワイスとリチャードソンは、細胞残渣の除去とストレプトマイシンの添加から始まり、ジエチルアミノエチル（DEAE）セルロースカラムで数回洗浄し、最後にホスホセルロース分画を行う6段階のクロマトグラフィー分画プロセスを用いて、初めて精製および特徴づけを行いました。最終抽出物には、 大腸菌 培地で最初に記録された活性の10%が含まれていました。このプロセスの中で、反応を最適化するにはATPとMg++が必要であることが発見されました。現在市販されている一般的なDNAリガーゼは、もともとバクテリオファージT4、大腸菌、その他の細菌で発見されました。[17]
障害
ヒトDNAリガーゼの遺伝子欠損は、免疫不全、放射線感受性、発達異常を特徴とする臨床症候群と関連付けられている [16] 。LIG4症候群（リガーゼIV症候群）は、DNAリガーゼ4の変異に関連する稀な疾患であり、dsDNAの切断修復機構を阻害する。リガーゼIV症候群は、個人に免疫不全を引き起こし、一般的に小頭症や骨髄低形成を伴う。[18] DNAリガーゼの欠損または機能不全によって引き起こされる一般的な疾患のリストは以下のとおりである。
色素性乾皮症
色素性乾皮症（XP）は、日光からの紫外線（UV）に対する極度の過敏症を特徴とする遺伝性疾患です。この疾患は主に目と日光にさらされる皮膚部位に発症します。患者によっては神経系にも問題が生じることがあります。[19]
毛細血管拡張性運動失調症
ATM遺伝子の変異は、 毛細血管拡張性運動失調症（ATM）を引き起こします。ATM遺伝子は、細胞分裂の制御を助け、DNA修復に関与するタンパク質の合成指示を提供します。このタンパク質は、神経系や免疫系を含むいくつかの身体系の正常な発達と活動において重要な役割を果たします。ATMタンパク質は、細胞が損傷または切断されたDNA鎖を認識するのを助け、切断された鎖を修復する酵素を活性化することでDNA修復を調整します。損傷したDNA鎖の効率的な修復は、細胞の遺伝情報の安定性を維持するのに役立ちます。この疾患に罹患した小児は、通常、歩行困難、バランス感覚および手指協調運動障害、不随意なけいれん運動（舞踏病）、筋肉のけいれん（ミオクローヌス）、神経機能障害（神経障害）を呈します。これらの運動障害により、思春期までに車椅子での介助が必要になることがよくあります。この疾患の患者は、ろれつが回らないことや、左右を見るために眼球を動かすのが困難なこと（眼球運動失行）も呈します。[20]
ファンコニ貧血
ファンコニ貧血（FA）は、骨髄不全を引き起こすまれな遺伝性血液疾患です。FAは、骨髄が体が正常に機能するために必要な量の新しい血液細胞を産生するのを阻害します。また、FAは骨髄に多くの欠陥のある血液細胞を産生させる原因にもなり得ます。これは白血病などの深刻な健康問題につながる可能性があります。[21]
ブルーム症候群
ブルーム症候群は、日光への曝露に対して皮膚が敏感になり、通常、鼻と頬に蝶形の赤くなった皮膚の斑点が現れます。発疹は、手の甲や前腕など、日光によくさらされる他の部位にも現れることがあります。発疹の中には、拡張した血管の小さな塊（毛細血管拡張症）が現れることが多く、毛細血管拡張症は目にも現れることがあります。その他の皮膚症状としては、周囲よりも明るい部分（低色素沈着）や暗い部分（色素沈着過剰）が現れることがあります。これらの斑点は日光にさらさない部位に現れ、発疹とは関係ありません。
薬剤ターゲットとして
最近の研究では、ヒトDNAリガーゼIがコンピュータ支援薬物設計に用いられ、癌治療薬として期待されるDNAリガーゼ阻害剤が同定されました。[22]過剰な細胞増殖は癌発生の特徴であるため、DNAリガーゼの機能を阻害する標的化学療法は、アジュバント癌の発生を阻害する可能性があります。さらに、DNAリガーゼはATP依存性とNAD +依存性の2つのカテゴリーに大別できることが示されています。これまでの研究では、NAD +依存性DNAリガーゼは細菌領域外の散発的な細胞ニッチやウイルスニッチで発見されていますが、真核生物にNAD +依存性リガーゼが存在する例は見当たりません。NAD +依存性ヒトDNAリガーゼは、真核生物以外でのみ存在し、基質特異性も特異であり、ATP依存性ヒトDNAリガーゼと比較してドメイン構造が特徴的であるため、NAD +依存性リガーゼは新しい抗菌薬開発の理想的な標的となっています。[16]
参照
参考文献
- ^ Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (2004年11月). 「ヒトDNAリガーゼIは切断されたDNAを完全に包み込み、部分的に解く」. Nature 432 ( 7016 ): 473–8 . Bibcode :2004Natur.432..473P. doi :10.1038/nature03082. PMID 15565146. S2CID 3105417.
- ^ Lehman IR (1974年11月). 「DNAリガーゼ：構造、メカニズム、そして機能」. Science . 186 (4166): 790–7 . Bibcode :1974Sci...186..790L. doi :10.1126/science.186.4166.790. PMID 4377758. S2CID 86549159.
- ^ ab Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiology: An Evolving Science (Second ed.). New York: WW Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2。
- ^ Yang Y, LiCata VJ (2018年2月). 「Pol I DNAポリメラーゼは大腸菌DNAリガーゼによるDNA末端結合を促進する」.生化学および生物理学的研究通信. 497 (1): 13– 18. Bibcode :2018BBRC..497...13Y. doi : 10.1016/j.bbrc.2018.01.165 . PMID 29409896.
- ^ 「リガーゼ」（PDF） .酵素リソースガイド. Promega Corporation. pp. 8– 14.
- ^ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (2013年7月). 「in vitro活性を向上させた改変DNAリガーゼ」. Protein Engineering, Design & Selection . 26 (7): 471–8 . doi : 10.1093/protein/gzt024 . PMID 23754529.
- ^ Baldy MW (1968). 「T4ファージにおける修復と組換え。II. UV感受性に影響を与える遺伝子」. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology . 33 : 333–8 . doi :10.1101/sqb.1968.033.01.038. PMID 4891973.
- ^ Baldy MW (1970年2月). 「T4ファージの初期機能温度感受性変異体の紫外線感受性」. Virology . 40 (2): 272–87 . doi :10.1016/0042-6822(70)90403-4. PMID 4909413.
- ^ Baldy MW, Strom B, Bernstein H (1971年3月). 「ポリヌクレオチドリガーゼを介したメカニズムによるアルキル化バクテリオファージT4デオキシリボ核酸の修復」. Journal of Virology . 7 (3): 407–8 . doi :10.1128/JVI.7.3.407-408.1971. PMC 356131. PMID 4927528 .
- ^ Tomkinson, Alan E; Sallmyr, Annahita (2013年9月5日). 「哺乳類LIG3遺伝子によってコードされるDNAリガーゼの構造と機能」. Gene . 531 (2): 150–157 . doi :10.1016/j.gene.2013.08.061. PMC 3881560. PMID 24013086 .
- ^ 「AmpliGase- Thermostable DNA Ligase」www.epibio.com . 2017年6月19日時点のオリジナルよりアーカイブ。2017年5月15日閲覧。
- ^ Russell DW, Sambrook J (2001). 「第1章 プラスミドと分子クローニングにおけるその有用性」.分子クローニング：実験マニュアル. 第1巻（第3版）. コールド・スプリング・ハーバー（ニューヨーク州）: コールド・スプリング・ハーバー研究所. pp. 1– 159. ISBN 978-0-87969-577-4。
- ^ Baneyx F, Lucotte G (1993).分子クローニング技術入門. チチェスター: John Wiley & Sons. p. 156. ISBN 978-0-471-18849-0。
- ^ ab Tabor S (2001年5月). 「DNAリガーゼ」. Current Protocols in Molecular Biology . Chapter 3: Unit 3.14. doi :10.1002/0471142727.mb0314s08. ISBN 978-0-471-14272-0. PMID 18265223. S2CID 23944826.
- ^ Bhanjadeo MM, Nayak AK, Subudhi U (2017). 「表面支援DNA自己組織化：酵素を使わない分岐DNA格子形成戦略」.生化学および生物理学研究通信. 485 (2): 492– 498. Bibcode :2017BBRC..485..492B. doi :10.1016/j.bbrc.2017.02.024. PMID 28189681.
- ^ abc Shuman S (2009年6月). 「DNAリガーゼ：進歩と展望」. The Journal of Biological Chemistry . 284 (26): 17365–9 . doi : 10.1074/jbc.R900017200 . PMC 2719376. PMID 19329793 .
- ^ Weiss B, Richardson CC (1967年4月). 「酵素によるデオキシリボ核酸の切断と結合、I. T4バクテリオファージに感染した大腸菌由来の酵素系によるDNA一本鎖切断の修復」米国科学アカデミー紀要. 57 (4): 1021–8 . Bibcode :1967PNAS...57.1021W. doi : 10.1073/pnas.57.4.1021 . PMC 224649. PMID 5340583 .
- ^ Altmann T, Gennery AR (2016年10月). 「DNAリガーゼIV症候群：レビュー」. Orphanet Journal of Rare Diseases . 11 (1) 137. doi : 10.1186/s13023-016-0520-1 . PMC 5055698. PMID 27717373 .
- ^ 「色素性乾皮症」. Genetics Home Reference . 2017年5月15日閲覧。
- ^ 「毛細血管拡張性運動失調症」. Genetics Home Reference . 2017年5月15日閲覧。
- ^ 「ファンコニ貧血とは？」NHLBI、NIH。2011年9月3日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2017年5月15日閲覧。
- ^ Tomkinson AE, Howes TR, Wiest NE (2013年6月). 「DNAリガーゼを治療標的として」. Translational Cancer Research . 2 (3). PMC 3819426. PMID 24224145 .
外部リンク
