化学において、ダーククエンチャー（ダークサッカーとも呼ばれる）は、蛍光体からの励起エネルギーを吸収し、そのエネルギーを熱として散逸させる物質である。一方、典型的な（蛍光）クエンチャーは、このエネルギーの多くを光として再放出する。[1]ダーククエンチャーは、分子生物学において蛍光体と組み合わせて用いられる。分子やタンパク質のように、両者が近接している場合、蛍光体の発光は抑制される。この効果は、分子の形状や運動を研究するために用いられる。
その使用例としては、TaqManやインベーダーアッセイ、SNP遺伝子型判定法などが挙げられます。例えば、ステムの基部に蛍光色素と消光剤を配したヘアピンループが用いられます。特異的な5'末端を持つ、標識されていないSNP特異的PCRプライマー（多数あるうちの1つ）がプローブ対象の配列に結合し、TaqポリメラーゼがSNPに依存した特異的な5'末端を持つ配列を伸長させます（対象SNPの上流の多型には影響されません）。次の反応では、その末端に相補的な、ヘアピンループを持つプライマーが伸長されます。次の反応では、相補鎖の伸長によって、蛍光色素と消光剤を隔てるヘアピンが直線化されます。消光剤を使用する代わりに、2つの色素の組み合わせがシグナルを発するFRETが用いられます。 [2]
機能モード
ダーククエンチャーは、本来蛍光を持たない色素です。ここ数年まで、クエンチャーは典型的には二次蛍光色素、例えばレポーターとしてフルオレセイン、クエンチャーとしてテトラメチルローダミン（FAM/TAMプローブ）として用いられてきました。しかし、クエンチャーの蛍光は、クエンチャーとレポーターの蛍光スペクトルの重なりにより、バックグラウンドノイズを増加させる可能性があります。この制限により、複雑なデータ解析や光学フィルターの使用が必要になることがよくあります。ダーククエンチャーは発光帯域を占有しないため、この問題の解決策となります。さらに、ダーククエンチャーはマルチプレックス化（2つ以上のレポーター-クエンチャープローブを併用する）を可能にします。
蛍光色素は光を吸収し、励起状態になります。その後、色素は光（蛍光）を発することで励起状態から基底状態に戻ります。レポーター-クエンチャー系では、色素は無放射（光なし）でクエンチャーにエネルギーを伝達します。これにより色素は基底状態に戻り、クエンチャー励起状態が生成されます。その後、クエンチャーは発光減衰（蛍光）または無放射減衰（暗消光）によって基底状態に戻ります。無放射減衰または暗減衰では、エネルギーは分子振動（熱）によって放出されます。サンプルの濃度が通常μM以下であれば、無放射減衰による熱は溶液の温度に影響を与えるほど小さくなります。
ダーククエンチャーの例
- ダブシル（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）は緑色のスペクトルを吸収するため、フルオレセインと併用されることが多いです。（ダブシルはほぼ同じ吸収を示しますが、スクシンイミジルエステルの代わりに、より安定した複合体を形成するためにスルホニルクロリドを持っています。）
- ブラックホール クエンチャーは、可視スペクトル全体にわたって消光することができます。
- Qxl クエンチャーは可視スペクトル全体をカバーします。
- アイオワ ブラック FQ は、スペクトルの緑とピンクの部分を吸収します。
- アイオワ ブラック RQ は、スペクトルのオレンジレッドおよび蛍光部分をブロックします。
- IRDye QC-1は可視光線から近赤外光（500～900 nm）の範囲の色素を消光する。[3]
参考文献
- ^ Osterman, H., The Next Step in Near Infrared Fluorescence: IRDye QC-1 Dark Quencher, 2009; Review Article. PDFをダウンロード（2011年7月13日アーカイブ）
- ^ Peng, X., Chen, H., Draney, DR, Volcheck, WM, FRETアッセイ用非蛍光広範囲クエンチャー色素, Analytical Biochemistry, 2009; (Vol. 388), pp. 220–228. PDFをダウンロード（2011年7月13日アーカイブ）
- ^ Peng, X., Draney, DR, Volcheck, WM, HIV-1プロテアーゼアッセイのための消光近赤外蛍光ペプチド基質, Proc. SPIE, 2006; (6097), [1] [ permanent dead link ]
さらに読む
- J. Lakowicz、「蛍光分光法の原理」、第 2 版、Plenum、ニューヨーク、1999 年。
- Johansson, MK; Cook, RM (2003). 「分子内二量体：蛍光消光プローブの新たな設計戦略」. Chem. Eur. J. 9 ( 15): 3466– 3471. Bibcode :2003ChEuJ...9.3466J. doi : 10.1002/chem.200304941 . PMID 12898673.
外部リンク
- Invitrogen ハンドブック: QSY 色素。
- IRDye QC-1 ユニバーサルクエンチャー (500-900 nm)
