脱パイロジェン
Removal of pyrogens from solutions

脱発熱物質処理とは、溶液、特に注射用医薬品から 発熱物質を除去することを指します。

発熱物質とは、発熱を引き起こす可能性のある物質と定義されます。細菌性発熱物質には、エンドトキシンとエキソトキシンが含まれますが、多くの発熱物質は宿主にとって内因性です。エンドトキシンには、グラム陰性細菌の細胞壁に含まれるリポ多糖（LPS）分子が含まれ、細菌細胞の溶解時に放出されます。エンドトキシンは、通常は存在しない血流やその他の組織に放出されると、発熱性を発揮する可能性があります。大腸にはグラム陰性細菌が豊富に存在しますが、細菌は著しく溶解しておらず、大腸壁が損傷していない間は免疫系が遊離エンドトキシンにさらされないため、発熱作用は引き起こしません。

細菌細胞が溶解してLPSが放出されると、脂質A成分はまず血清中のLPS結合タンパク質（LBP）に結合し、次にCD14（血清中の遊離CD14かマクロファージや単球の細胞表面に結合したCD14）に転移する。凝集したLPSはLPS受容体であるTLR4（Toll様受容体4）が認識できないため、この反応によって凝集LPSが単量体化する。次に単量体LPSはマクロファージや単球上でTLR4とあらかじめ複合体を形成したMD-2に転移する。これにより炎症誘発性サイトカインや一酸化窒素が放出され、反応の強さによっては最終的に敗血症性ショックを引き起こす可能性がある。血管内皮細胞もTLR4とMD-2を発現しているため、サイトカインや一酸化窒素を介してだけでなく、直接LPSに反応する。気管支上皮細胞と結腸上皮細胞も TLR4 を発現しますが、MD-2 を発現しないため、LPS にシグナルを送るために血清 MD-2 と事前複合された LPS に依存します。

最大許容エンドトキシンレベル

エンドトキシンの分子量は10,000～1,000,000Daと大きく異なるため、エンドトキシン濃度は「エンドトキシン単位」（EU）で測定されます。1EUは、大腸菌リポ多糖100pg（約10 5 個の細菌に含まれる量）にほぼ相当します。ヒトは、体重1kgあたりわずか5EUのエンドトキシンに曝露されただけでも症状を発症する可能性があります。これらの症状には、発熱、低血圧、心拍数の増加、尿量減少などが含まれますが、これらに限定されるものではありません。血流中に少量のエンドトキシンが流入しただけでも、しばしば致命的となります。

米国食品医薬品局は、米国で流通する医薬品に対して、以下の最大許容エンドトキシン濃度を設定しています。

  • 薬剤（注射剤、髄腔内） - 体重1kgあたり0.2 EU
  • 薬剤（注射剤、非脊髄内） - 体重1kgあたり5 EU
  • 滅菌水 - 0.25～0.5 EU/ml（用途によって異なります）

発熱物質検出

ウサギ試験

初期のエンドトキシン検出は、ウサギにサンプルを注射し、体温の反応を観察することによって行われました。ウサギはヒトと同様のエンドトキシン耐性を持っているため、理想的な選択肢でした。しかし、この方法は費用と時間がかかり、動物愛護団体からの抗議を引き起こしました。しかし、おそらくこの試験の最大の欠点は、エンドトキシンレベルを定量化できないことでした

LALテスト

現在、エンドトキシン検出の一般的な方法の一つは、カブトガニ血球溶解物（LAL）試験です。この試験は、カブトガニの血液がエンドトキシンにさらされると凝固するというフレデリック・バン博士の観察に基づいています。[1]カブトガニの血液から抽出したアメーボサイト抽出物を、エンドトキシン汚染が疑われる検体と混合し、エンドトキシンが存在する場合に反応を観察します。FDAは、ゲル化法、比色法、比色法、および発色法の4種類のLAL試験を承認しています。これらの違いは、アメーボサイト／エンドトキシン反応の特性（例えば、ゲル化法では沈殿物を生成し、比色法では色が変化）を示しています。この試験は迅速（約30分）で高感度（最大0.001 EU/mlの感度）です。ただし、LPSエンドトキシンのみを検出するため、一部の発熱性物質を見逃す可能性がありますまた、特定の条件（最適ではないpH条件や不適切な陽イオン濃度など）は偽陰性につながる可能性があります。また、炭水化物クロマトグラフィーマトリックス由来のグルカンも偽陽性につながる可能性があります。[2]

2003年以降、LAL試験の合成代替品が市販されています。この組換えC因子（rFC）試験は、LALのLPS感受性部分であるカブトガニ凝固因子Cに基づいています。この試験の普及は遅々として進みませんでしたが、2016年に欧州薬局方がこの試験を細菌毒素試験として承認したことで、状況は変わり始めました。[3]

単球活性化試験

単球活性化試験（MAT）は、ヒト血液中の単球を用いて試験管内で発熱物質を検出する試験です。2010年に欧州薬局方に追加され、2012年にFDAに承認されました。[4]

発熱物質の除去（脱パイロジェン化）

発熱物質は分子量の変動が大きいため、溶液から除去することが困難な場合が多くあります。また、発熱物質は比較的熱的に安定しており、pHの変化の影響を受けません。しかしながら、いくつかの除去技術が存在します。[5]

イオン交換クロマトグラフィー

エンドトキシンは負に帯電しており、陰イオン交換体に結合します。対象物質も負に帯電していなければ、エンドトキシンより先にカラムを通過し、効率的な分離が達成されます。この方法は、アルブミンの精製に時々使用されます（詳細は後述）。エンドトキシンとの親和性が知られているリガンドを陰イオン交換システムに結合させることで、エンドトキシン結合強度を高め、最終製品の純度をさらに向上させることができます。エンドトキシン結合リガンドの代表的な例としては、ヒスタミン、含窒素複素環式化合物、ポリミキシン Bなどがあります。ただし、ポリミキシン Bは外因性発熱物質であるインターロイキン-1 の生成を誘導することが知られているため、使用する場合には最終製品中にポリミキシン B が存在しないことが示されなければなりません。
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたアルブミンの精製例： [6]
  • エンドトキシンの2%はカラムに結合しません。しかし、この2%はアルブミンのピークの前に洗い流されるため、この2%が洗い流された後に分取を開始するだけで除去できます。
  • カラムに結合したエンドトキシンの10% （元の総量の9.8%）は、アルブミンのピーク後に最終的に洗い流されます。この現象が起こる前に回収を停止することで、最終製品へのエンドトキシンの混入を防ぐことができます。
  • 結合したエンドトキシンの残りの90％（元の合計の88.2％）はNaOHを使用してカラムから除去する必要がある。
陰イオン交換の代替として陽イオン交換クロマトグラフィーがあります。この方法では、正に帯電した溶質が固体クロマトグラフィー媒体に結合します。この方法では、エンドトキシンではなく標的物質がカラムに結合します。その後、エンドトキシンはカラムを通過し、純粋な標的物質がカラムから溶出されます。陽イオン交換クロマトグラフィーはβ-インターフェロンを効果的に精製することが示されている。(Dembinskiら) [7]

限外濾過

エンドトキシンの分子量は通常10kDを超えるため、サイズに基づく分離法として限外濾過法が用いられることがあります。エンドトキシンのサイズは大きく変動するため、適切な膜の選択が困難な場合があり、この方法は存在するすべてのエンドトキシンが300,000Daを超える場合にのみ最適です。市販の限外濾過膜は、発熱物質を0.001 EU/ml未満のレベルまで除去できることが示されています。[要出典]

蒸留

この方法も、エンドトキシンの大きな分子量と熱安定性に基づいています。低分子量の溶媒は、沸騰させて凝縮した蒸気をエンドトキシンフリーの容器に集めることで簡単に精製できます（下記の「加熱」を参照）。大きなLPS分子は容易に蒸発しないため、加熱容器内に残ります。これは水の浄化に最適な方法です

不活化／破壊

発熱物質は除去が難しい場合が多いため、LPS分子の不活化または破壊が望ましい場合があります

酸塩基加水分解

この方法は、LPS分子中の多糖類からリピドAを切断することが示されています（右図参照）。脂質部分のみは水に溶けません。そのため、内皮細胞に結合できず、不活性になります。しかし、酸塩基加水分解は標的タンパク質を変性させる可能性があるため、タンパク質の精製には適していません

酸化

過酸化水素を用いた酸化は、低コストの発熱物質破壊溶液としてよく使用されます。この破壊のメカニズムは不明ですが、過酸化水素は精製プロセスの下流で容易に除去できるため、発熱物質除去の有用な方法です。しかし、酸塩基加水分解と同様に、タンパク質の精製には適していません

加熱

加熱法は、ガラスやその他の実験器具に発熱物質が付着していないことを確認するためによく用いられます。加熱は、脱パイロジェン処理用に特別に設計された乾熱オーブンで焼くことで行われます。エンドトキシンは比較的熱的に安定していますが、十分な加熱（250℃、30分）を行うと、エンドトキシンレベルは3分の1に減少します。高温であるため、この方法はタンパク質の精製には適していません

アルカリ

タンパク質を精製する際には、水酸化ナトリウム（NaOH）などのアルカリを安全かつ効果的に使用できます。また、オートクレーブできない機器（プラスチックなど）やクロマトグラフィーカラムの脱パイロジェン化にも広く使用されています。実際、陰イオン交換体を用いてパイロジェンを除去する場合、バッチごとにカラムをNaOHで洗浄する必要があります

予防方法

工場の従業員を含め、製造工程に関わるほぼすべての原材料は、発熱物質汚染の潜在的な発生源となる可能性があるため、原材料のスクリーニングと脱パイロジェン化は、最終製品に発熱物質が含まれないことを保証し、高価な除去や不活化方法を必要としない上で、非常に役立ちます。化学薬品や緩衝液の限外ろ過、適切な衛生管理の適用、定期的な検査の実施など、すべてが役立ちます

参照

参考文献

  1. ^ グリア、スペンサー；ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院「フレデリック・バン」健康学、ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院。
  2. ^ [Sandle, T. (2013). 医薬品の不純物：ベータグルカンの考慮, American Pharmaceutical Review, 16 (5) Supplement S1: 16-19]
  3. ^ マロニー、トム、フェラン、ライアン、シモンズ、ナイラ（2018年10月12日）「カブトガニを救う：エンドトキシン検出のためのカブトガニ血液の合成代替法」PLOS Biology 16 ( 10) e2006607. doi : 10.1371/journal.pbio.2006607 . PMC 6200278. PMID  30312293 . 
  4. ^ 「発熱物質およびエンドトキシン試験に関するガイダンス：質問と回答」米国食品医薬品局（FDA）2012年6月。2022年1月25日時点のオリジナルよりアーカイブ。
  5. ^ Sandle, Tim (2011年10月). 「細菌性エンドトキシンを用いた脱パイロジェン試験への実践的アプローチ」. Journal of GXP Compliance . 15 (4).
  6. ^ アルブミンからのエンドトキシンおよび／またはエタノールのクロマトグラフィーによる除去。アプリケーションノート206。Pharmacia Biotech.、ウプサラ、1990年。
  7. ^ Dembinski, W.; O'Malley, JA; Sulkowski, E. ヒト線維芽細胞インターフェロンの大規模精製手順。インターフェロン科学メモランダ、1月/2月、6日（1983年）。
  • Sofer, G.; Hagel, L. (1997). プロセスクロマトグラフィーハンドブック：最適化、スケールアップ、バリデーションガイド. Academic Press, 158-161. ISBN 0-12-654266-X
  • トゥールズ、N.およびサンドル、T. 3種類のグラム陰性細菌エンドトキシンを用いた乾熱脱パイロジェンの比較、European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences、第13巻、第1号、2008年、17～20ページ
  • LALアップデート
  • 脱パイロジェンLALアップデート
  • FDA規制局：検査技術ガイド、細菌性エンドトキシン／パイロジェン
  • 細菌学教科書
  • カブトガニの医療利用
  • 細菌性エンドトキシンを用いた脱パイロジェン研究への実践的アプローチ
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