EPIC-Seq
図1. このフローチャートは、遊離DNA（cfDNA）を解析する包括的な手法であるEPIC-Seqのワークフローを示しています。最初のステップでは、液体生検によって患者の血漿からcfDNAを抽出します。次に、特殊なプローブを用いて標的遺伝子の転写開始部位（TSS）領域内のリードを捕捉し、正確なゲノムカバレッジを確保します。標的遺伝子のTSS領域内のcfDNAを捕捉すると、次の段階では、プロモーター断片化エントロピー（PFE）やヌクレオソーム枯渇領域（NDR）の深度などのフラグメントミクス特性を計算し、DNA断片の構造特性に関する知見を提供します。最後に、すべての標的のNDRとPFEを特性として活用することで、患者の遺伝子発現プロファイルを推測する機械学習モデルが構築され、分子シグネチャの解釈を容易にし、診断および予後評価を支援します。

EPIC-seq （ Ep igenetic Expression I nference by Cell -free DNA Seq uencingの略）は、細胞外DNA （cfDNA）シーケンシングを用いて遺伝子プロモーター領域を特異的に標的とするハイスループット手法です。血液サンプル採取などの非侵襲的手法を用いることで、標的遺伝子の発現レベルを推定します。ウェットラボとドライラボの両方の段階から構成されます。[ 1 ]

EPIC-seqは転写開始部位（TSS）のディープシーケンシングを伴います。このTSSのディープシーケンシングにより、フラグメントミクスの特徴、すなわちクロマチン断片化パターンや特性を利用することで、他の方法に比べて高解像度の解析が可能になるという仮説が立てられています。[ 1 ]

この手法は、遺伝子レベルの発現推定、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）の分子サブタイピング、非小細胞肺癌（NSCLC）の組織学的分類、免疫療法剤の効果評価、遺伝子の予後的重要性の評価に有効であることが示されています。EPIC-seqは機械学習を用いて遺伝子のRNA発現を推定し、2つの新しい指標を提案しています。プロモーター断片化エントロピー（PFE）、エントロピーの調整シャノン指数[ 2 ]とヌクレオソーム枯渇領域（NDR）スコア、NDR領域のシーケンス深度です。PFEは、フラグメントミクス特性の以前の指標と比較して優れた性能を示しました。[ 1 ]

さらに、EPIC-seqは、cfDNAのメチル化プロファイルを用いた組織損傷や食道癌の検出、[ 3 ] [ 4 ] 、ドナー肝臓分子ネットワークのプロファイリング、[ 5 ]、炎症性腸疾患[ 6 ]（IBD）の検出のための可能な解決策として言及されています。

背景

cfDNAとフラグメントミクス特性の歴史的利用

cfDNAは、血漿中に含まれる細胞死関連およびクロマチン断片化DNA分子であり、これまでの研究において、移植組織拒絶反応の検出、出生前胎児異数性検査、腫瘍プロファイリング、早期癌検出に使用されてきました。 [ 7 ]しかしながら、cfDNAプロファイリングのための一般的な液体生検法は、生殖細胞系列または体細胞の遺伝子変異の検出に依存しており、これらは、疾患負荷の高い患者や腫瘍変異率の高い癌においても検出されない可能性があります。[ 1 ]

歴史的に、 cfDNAサンプルのフラグメントミクス特性の利用は、前述の問題へのアプローチとして別の方法であることが示されてきた。[ 8 ] [ 9 ]彼らは、 cfDNA分子の起源組織分類に関する情報を提供できることを実証し、腫瘍関連の体細胞変異の分離に役立つ可能性がある。[ 10 ] [ 11 ]しかし、cfDNAの浅い全ゲノムシーケンシング（WGS）など、フラグメントミクス特性を利用する現在の方法は、すべての組織の影響を完全にカバーしておらず、シーケンシングの深さと幅が狭いため、遺伝子レベルなどの低レベルの特性を推測することができない。したがって、これらの方法は患者に高い腫瘍負荷を課すことになる。[ 1 ]

循環腫瘍DNAプロファイリング

循環腫瘍DNA（ctDNA）分子は、血流中を循環している腫瘍由来の遊離DNA（cfDNA）であり、細胞とは関連がありません。ctDNAは主に、腫瘍細胞の死に伴うクロマチン断片化から生じ[ 12 ]、液体生検で抽出できます。[ 13 ] ctDNA分析は、腫瘍の遺伝的特徴の非侵襲的識別と、さまざまな癌の形態の早期認識のために実施されています。[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]現在のctDNA分析の大部分は、生殖細胞または体細胞の遺伝的差異に依存して疾患を診断し、腫瘍細胞を早期に検出します。[ 11 ] [ 2 ] [ 12 ] ctDNAの遺伝的変異を見ることは有益ですが、すべてのctDNAに遺伝子変異が含まれているわけではありません。 EPIC-seqはctDNAのエピジェネティックな特徴を統合して、変異していない分子の起源組織を知らせるものであり[ 1 ] 、これは癌の分類に役立ちます。

組織起源分類のためのフラグメント特徴

循環cfDNA分子の大部分はヌクレオソームに結合した断片であるため、それらが由来する細胞の核ゲノムに見られる特有のクロマチン配列を示す。[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]特に、オープンクロマチン領域はjであるのに対し、ヌクレオソーム複合体に結合したゲノム領域はエンドヌクレアーゼ活性から保護されていることが多い。[ 17 ]いくつかの研究では、 cfDNAプロファイリングを通じて組織の起源を明らかにするのに役立つ特定のクロマチンフラグメント特性が特定されている。これらの特性には以下が含まれる。

  1. シーケンシングカバレッジ深度の減少[ 8 ] [ 18 ] [ 19 ]
  2. 転写開始部位（TSS）付近のヌクレオソーム配置の破壊[ 17 ]
  3. cfDNA断片の長さ[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]

EPIC-seqの原理

図2. プロモーター断片化エントロピー（PFE）とヌクレオソーム枯渇領域（NDR）を説明する図

現在、循環腫瘍DNA（ctDNA）フラグメントミクス技術の大部分は遺伝子レベルの分解能を達成できず、主にctDNAレベル上昇時の発現を推測する効果しかありません。そのため、これらの技術は主に、典型的には末期癌に見られる、著しく進行した腫瘍量を有する患者に適用可能です。[ 1 ]

この限界に対処するため、EPIC-seqは、cfDNAの転写開始部位（TSS）に隣接する領域を対象としたハイブリッドキャプチャーベースのターゲットディープシーケンシングを採用しています。このアプローチにより、プロモーター断片化エントロピー（PFE）やヌクレオソーム枯渇領域（NDR）など、遺伝子発現の予測に不可欠なctDNA断片化特性を取得できます。[ 1 ]これらの重要なフラグメントミクス特性は、遺伝子レベルとゲノム全体の発現レベルの関連性を捉える能力を備えており、転写出力の予測モデルの構築を可能にします。これにより、cfDNA断片化の高解像度モニタリングと遺伝子レベルの解析が可能になります。[ 1 ]

プロモーター断片化エントロピー

Epic-seqは、活性プロモーター由来のcfDNA断片はヌクレオソームによる遮蔽が少なく、エンドヌクレアーゼによる切断を受けやすいため、ヌクレオソームによる保護が強い不活性プロモーター由来の断片と比較して、より不規則な切断パターンを示すと仮定している。PFEは、多様性を推定するための定量的な指標であるシャノン指数の一種である。Epic-seqにおいて、PFEはcfDNA断片の両端が各遺伝子のTSSの2 kbの隣接領域内に位置する場合の断片長の多様性を計算する。遺伝子のTSSのPFEが高いほど、その遺伝子が高度に発現している可能性が高い。[ 1 ]

ヌクレオソーム欠損領域

活発に発現している遺伝子は、TSS領域でクロマチンが開いているため、ヌクレオソームによる遮蔽が少なく、エンドヌクレアーゼによる切断を受けやすくなります。その結果、活性遺伝子のTSSに由来するcfDNAの深さは、不活性遺伝子のそれと比較して浅くなる傾向があります。NDRは、各TSSを囲む2キロベースのウィンドウ内の正規化された深さを定量化します。遺伝子のTSS部位のNDRが低いほど、その遺伝子が高度に発現している可能性が高くなります。[ 1 ]

方法

ウェットラボのワークフロー

1. 血漿の採取と処理

末梢血サンプルを採取し、標準プロトコルに従って血漿を分離した。遠心分離後、血漿検体は-80℃で保存し、ctDNAの抽出を待った。2 ～16mlの血漿量からのcfDNAの抽出は、確立された実験室手順を用いて実施した。分離後、 cfDNA濃度は蛍光定量法を用いて測定した。[ 1 ]

2. シークエンシングライブラリの準備

ライブラリ調製には、通常32 ngのcfDNAが用いられました。高分子量DNAの混入の影響を軽減するため、 DNAインプット量は調整されました。ライブラリ調製プロセスには、末端修復、Aテーリング、アダプターライゲーションが含まれ、各リードに分子バーコードも組み込まれました。これらの手順は、ライゲーションベースのライブラリ調製の標準プロトコルに従って実施され、ライゲーションは4℃で一晩実施されました。その後、ショットガンcfDNAライブラリは、特定のゲノム領域を標的としたハイブリッドキャプチャーを受けました。詳細は以下に記載されています。[ 1 ]

3. カスタムキャプチャパネルのシーケンス

EPIC-seqでは、特定のがん種に合わせたカスタムキャプチャパネル、またはパーソナライズされたセレクターが使用されました。キャプチャパネルは、対象遺伝子の転写開始部位領域をターゲットとしていました。EPIC-seqのためのエンリッチメントは、確立された実験室プロトコルに従って実施されました。その後、ハイブリダイゼーションキャプチャをプールし、プールされたサンプルをショートリードシーケンシングを用いてシーケンシングしました。[ 1 ]

ドライラボのワークフロー

EPIC-seqには、ウェットラボ部分の後にさらなる処理のための計算部分が含まれているため、以下の手順は、元の論文に記載されている開発者の手順に基づいてまとめられています。[ 1 ]

4. 多重分離とエラー訂正

マルチプレックスペアエンドシーケンシングを使用する場合、異なるサンプルのリードを異なるファイルに分類するために、デマルチプレックスを行う必要があります。デマルチプレックス後、ペアの固有識別子とバーコードのマッチングに基づいて、エラー訂正とリードペアの除去を行うことができます。開発者は、CAPP-seq [ 16 ]のデマルチプレックスパイプラインからデマルチプレックスとエラー訂正の手順を適応させます。[ 1 ]

5. 外側のシーケンスの削除とトリミング

短いフラグメントリードを保持するには、バーコード除去とアダプタートリミングを行う必要がある。リード前処理後、リードとヒトゲノムリファレンスのアライメントを行う必要がある。オリジナルのEPIC-seqではhg19 [ 23 ]が使用されていたが、より良い結果を得るには、ヒトゲノムリファレンスの更新版を使用することができる。アライナによっては、短いリードと長いリードのペアを含めることを妨げる可能性があるため、アライナのオプションには注意する必要がある。[ 1 ]重複排除には、添付された分子カスタマイズバーコードを利用する必要がある。これらのバーコードには、内因性および外因性のユニーク分子識別子（UMI）が含まれており、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の重複を実際の重複と区別するのに便利であり、したがってPCR重複のクレンジングに便利である。この部分は、低い変異量がPCR重複によって抑制される可能性があるため、腫瘍学アプリケーションでは特に重要である。[ 1 ]

6. 読み取りの正規化と品質管理

異なるサンプルのデータを互いに対比する場合、比較可能性を高めるためにリードをダウンサンプリングすることができます。妥当な解析結果を得るために報告されたシーケンスカバレッジの深度は500倍以上と報告されているため、平均シーケンス深度がこの数値を超えないサンプルは、より正確な結果を得るために除外することができます。また、EPIC-seqは、染色体長に基づいて、140～185の推定期待cfDNAフラグメント長密度を使用します。外れ値のフラグメント長密度を持つサンプルは、より高い相関結果を得るために除外することができます。最後の品質管理ステップとして、マッピングの品質を考慮する必要があります。設計段階で課せられたTSS選択基準により、EPIC-seqのリードはよりユニークになるため、WGSと比較してEPIC-seqのリードに対してより緩い閾値を決定できます。[ 1 ]

フラグメントミクス特徴解析

7. シャノンのエントロピー

フラグメントミクス特徴の多様性を測定するために、シャノンのエントロピー指数[ 2 ]から導出されるPFE指標が開発されています。最大尤度法による密度推定には、長さ100から300の201個のビンのデフォルト数が使用されます。サイズ[ ]のフラグメントが存在する確率は、サイズ[ ]のフラグメントの数をフラグメントの総数で割ることによって計算されます。シャノンのエントロピー[ 2 ]は、次の式で計算されます。[ 1 ]99+i{\displaystyle 99+i}pi^{\displaystyle {\hat {p_{i}}}}99+i{\displaystyle 99+i}−∑i＝1201（pi^ログ2⁡（pi^））{\textstyle -\sum _{i=1}^{201}({\hat {p_{i}}}\log _{2}({\hat {p_{i}}}))}

8. ディリクレ多項式モデル

次に、異なるランによる異なるシーケンシング深度や、断片長分布の健全性を損なう可能性のあるその他の要因に対するクレンジングとして、ディリクレ多項式モデルによるベイズ正規化を行う必要があります。サンプルごとに、そのサンプルで観測された断片長に基づいて、多項式最尤推定に基づく断片長分布が生成されます。250塩基対の長さの2つの区間が使用され、それぞれ-1000塩基対から-750塩基対の間、およびTSSの中心から750塩基対から1000塩基対の間に位置しています。これは、選択された区間がTSSから比較的離れているため、生成された分布への遺伝子発現の影響を防ぐためです。次に、その分布から201断片サイズごとに断片長密度をサンプリングし、ディリクレ分布生成のパラメータとして使用します。[ 1 ]

ディリクレ分布の初期パラメータは20に設定される。得られたディリクレ分布から2000個のフラグメントをサンプリングし、それらに対してシャノンエントロピー[ 2 ]を計算する。次に、シャノンエントロピー[ 2 ]を、ランダムに選択された5つの背景セット（ただし、）のシャノンエントロピー[ 2 ]と比較する。[ 1 ]ei{\displaystyle e_{i}}1≤i≤5{\displaystyle 1\leq i\leq 5}

9. PFEの計算

PFEは、遺伝子特異的エントロピーが他のすべての背景セットのエントロピーの個々の倍よりも高くなる確率として計算されます。変数は、形状1、率0.5のガンマ分布からサンプリングされます。また、最後のステップとして、各背景における遺伝子特異的エントロピー確率の合計の期待値がPFEとして報告されます。この確率は、前のステップで生成されたディリクレ分布に基づいています。[ 1 ]（1+k）{\displaystyle (1+k)}k{\displaystyle k}

10. NDRの計算

NDRは、シーケンス深度の正規化された測定値であり、リードの前処理と品質管理のステップ中に、2000塩基対のウィンドウでデフォルトで2000倍にダウンサンプリングされます。[ 1 ]

11. 表情予測のための機械学習

ctDNA濃度が非常に低い原発不明癌患者のcfDNAのディープWGSデータを定量化し、ブートストラッピングを使用して機械学習モデルをトレーニングしました。5人の異なる患者のPBMCランに対するRNAシーケンシングの結果が記録され、これらの個人のうち3人の発現レベルの平均が遺伝子発現の参照として使用されます。遺伝子は、コアプロモーターでの解像度を高めるために、参照遺伝子発現に基づいて10のクラスターにクラスター化されます。次に、PFE計算の背景値として使用される遺伝子が除去されます。次に、TSS領域の中心を中心とし、長さが2000塩基対である領域である拡張TSS領域内のすべてのフラグメントがプールされます。プールされたフラグメントに対してPFEおよびNDRスコアが計算されます。これらのスコアのさらなる正規化は、95パーセンタイルに基づいて行われます。[ 1 ]

これらの2つの特徴を用いて、WGSデータ用に開発された600個の発現予測モデルを重み付けブートストラップ法で構築した。これらのモデルには、単変数スタンドアロンNDRモデルが200個、単変数スタンドアロンPFEモデルが200個、NDR-PFE統合モデルが200個含まれている。[ 1 ]

利点

高スループット

EPIC-seqは、ハイスループットシーケンシングの利点（高速シーケンシング時間、高いスケーラビリティ、高いシーケンシング深度、低コスト、低エラー率）を継承しています。EPIC-seqのもう1つの利点は、非侵襲性であることです。これにより、リスクの高い組織に対して侵襲的な手法を行う際のリスクも排除され、科学者は危険すぎる、または研究が困難な組織を研究することができます。[ 1 ]

高腫瘍量要件の独立性

序論で述べたように、先行手法の2つの大きな制限はEPIC-Seqには引き継がれていません。1つは一般的な液体生検法の生殖細胞系列または体細胞変異への依存性で、これは高疾患負荷患者においても確実に見つかるとは限りません。もう1つは、浅いWGS法のような方法のようにcfDNA組織の考慮範囲が不十分で、ゲノムの幅と深さが不十分なため解像度と遺伝子発現の推論レベルが低く、高解像度を得るにはやはり高い腫瘍負荷が必要になります。[ 1 ] EPIC-seqはバリアントコールではなくフラグメントミクス機能を使用するため、変異の存在に縛られません。また、全ゲノムではなくターゲットシーケンスを行うため、シーケンスの深さを増やすことができ、より良い解像度を提供できます。さらに、より感度が高く包括的な起源組織情報も提供します。[ 1 ]

異なる予測感度

さらに、この方法は、NSCLCおよびDLBCLの識別、NSCLCのサブタイプの組織学的分類、DLBCLのサブタイプの分子分類、DLBCLのCOO検出、進行NSCLC症例に対するプログラム細胞死リガンド1免疫チェックポイント阻害反応の予測、個々の遺伝子の予後価値の検出など、癌の識別、分類、治療効果の問題において一貫した性能を示しました。[ 1 ]

一般化可能性

EPIC-seqを用いてWESを実施したところ、生物学的シグナルと活性遺伝子のエクソン領域との相関が検出されました。[ 1 ]これは、EPIC-seqががん遺伝子だけでなく、関心のある 遺伝子の発現にも一般化できることを示しています

cfDNAレベルの堅牢性

一般的に、EPIC-seq分析の結果は、検査された生物学的効果と開発されたスコアとの間に有意な相関を示した。分類タスクでは、ROC（受信者動作特性曲線）曲線の下の面積（AUC）スコアが十分な有意区間で90％を超えた。また、これらのタスクでは、cfDNAレベルが1％未満であっても、パフォーマンスに悪影響を与えることはなかった。[ 1 ]そのため、この手法はcfDNAレベルに対しても優れた堅牢性を示している。最後に、EPIC-seqはさまざまな分析前要因の下で有意な変化を示さなかった。[ 1 ]これは、分析前に使用された機器やツールによって引き起こされる可能性のあるさまざまな状況下でこの手法が堅牢であることを証明している。

制限

EPIC-seqは様々な生物医学的応用において大きな可能性を秘めていますが、実装と解釈において考慮すべき制限も存在します

既知のがん関連遺伝子への依存

EPIC-seqの限界の一つは、特定のがんに関連する遺伝子に関する事前知識に依存していることです。EPIC-seqモデルの有効性は、対象となるがん種における包括的な遺伝子発現プロファイルの利用可能性にかかっています。この依存性により、遺伝子発現パターンが十分に特徴付けられているがんへの適用が制限され、分子シグネチャーの理解が不十分ながんへの有用性が制限される可能性があります。[ 1 ] [ 24 ]

特定のがん種への適用が限定的

EPIC-seqは、顕著な遺伝子を持つ癌や明確に定義された分子サブタイプを持つ癌においてより効果的である可能性がある。したがって、遺伝子プロファイルがそれほど明確でない癌や、患者間で大きなばらつきが見られる癌では、その有用性は限定的となる可能性がある。このため、異なる癌種への一般化は制限され、多様な腫瘍学的状況における結果の解釈には慎重さが求められる。[ 1 ] [ 24 ]

早期癌における限られたパフォーマンス

EPIC-seqは、 ctDNAレベルが高く、遺伝子変異がより顕著なため、進行期癌の検出において優れた性能を示す可能性があります。例えば、腫瘍DNA量が少ない（1%未満）患者では、EPIC-seqによるNSCLC検出感度は著しく低下し、検出率は約34%低下します。[ 1 ] [ 24 ]

用途

非侵襲性癌検出

EPIC-seqは、非侵襲的な癌検出、特に癌関連死亡の主な原因である肺癌の診断において顕著な可能性を示しています。EPIC-seqを用いることで、研究者らはNSCLC患者、DLBCL患者、そして健常者を高い精度で区別することに成功しています。[ 1 ]

癌のサブタイプの非侵襲的分類

EPIC-seqは、NSCLCを肺腺癌（LUAD）や肺扁平上皮癌（LUSC）などの組織学的サブタイプに分類することを可能にします。EPIC-seqは、 DLBCLにおける起始細胞（COO）サブタイプの分類にも役立ちます。[ 1 ]

治療反応予測

EPIC-seqは、診断と分類に加えて、免疫チェックポイント阻害薬（ICI）を含む様々ながん治療に対する患者の反応を予測する上で有望です。EPIC-seqで捕捉された遺伝子発現パターンの変化を分析することで、研究者はPD-(L)1阻害療法に対する患者の反応を予測することができ、これは個別化がん治療に大きな助けとなります。EPIC-seqから得られる指標は治療反応と有意な相関を示しており、治療結果予測のための潜在的な予後マーカーとなります。[ 1 ]

古典的ホジキンリンパ腫の免疫トランスクリプトームプロファイリング

EPIC-seqは、古典的ホジキンリンパ腫（cHL）のサブタイプにおけるエピジェネティックな発現の推定に有効であることが示されています。ホジキン細胞、リード/シュテルンベルグ細胞、およびそれらに対応するT細胞の発現は、EPIC-seqを用いて推定されました。バルク単一細胞RNAシーケンシングの結果は、これらの細胞型のEPIC-seqプロファイリングと有意な相関を示しました。[ 25 ]

考えられるユースケース

様々な分野の研究で、EPIC-seqの考えられるユースケースが言及されています。cfDNAの全ゲノムワイド特徴のための統合解析ツールキット（INAC）[ 26 ]は、EPIC-seqのPFEスコアとNDRスコアを含むさまざまなツールをまとめたもので、cfDNAの包括的なシリコ解析を提供します。これにより、病状と臨床転帰の推論、トランスクリプトームモデリング、コピー数プロファイリングなどが例示されます。EPIC-seqは、臨床IBD症例への潜在的な応用としても言及されています。高リスク群におけるIBDの監視や、 IBDによる前癌病変の発症に使用できます。また、現在の方法と比較して、臨床IBDによる腸管損傷の検出において優れた方法となる可能性も指摘されています。 [ 6 ]

代替案

EPIC-seqは遺伝子発現を推測するためのエピジェネティックマーカーを研究するため、ChIP-seq [ 27 ] 、ATAC-seq [ 28 ]、MeDIP-seq [ 29 ]、Bisulfite-Free DNA Methylation sequencing [ 30 ]などのエピジェネティックシーケンシング法を、 RNA-seq [ 31 ]やscRNA-seq [ 32 ]などのRNA発現プロファイリング法と組み合わせて研究することができます。

この方法は主に早期がん検出またはサブグループ分けのために開発されていることを考慮すると、Twist cfDNA Pan-Cancer Reference Standardなどの液体生検法を代替として使用することができます。さまざまな液体生検法が、非侵襲的にがんを早期に特定するために、遊離細胞腫瘍マーカー、腫瘍メチル化マーカー、エクソーム、タンパク質、脂質、炭水化物、電解質、代謝物、RNA、細胞外小胞、循環腫瘍細胞、および腫瘍教育血小板に焦点を当てています。[ 33 ]提案されている液体生検法には、 ATR-FTIR分光法[ 34 ]やCancerSEEK [ 35 ]などの包括的ながんタイプの検出を提供するものがあり、Dxcover [ 36 ]やSelectMdx [ 37 ]などの他の方法は、より具体的な（単一の）がんターゲットを対象としています。[ 33 ]

EPIC-seqはフラグメントミクスの特徴を利用して遺伝子発現レベルを推定します。いくつかの研究では、フラグメントミクスの特徴を用いて癌の存在、細胞死、移植不全などの他の臨床状態の検出も行っています。[ 38 ]

断片サイズ分析によるctDNA

この方法は、生体内およびコンピューター上でのctDNA断片長選択を用いて、血漿中の変異体の割合を濃縮する。この方法は、血中ctDNA断片長の特性に基づくサイズ選択基準に基づいて決定されるため、他の非侵襲的サンプリング方法には十分に一般化できない可能性がある。さらに、浅いWGSを用いたランダムフォレストやロジスティック回帰などの教師あり機械学習手法を用いて、がん患者と健常患者を分類する。この方法は、様々ながん種に用いることができる。[ 20 ]

血漿DNAエンドモチーフプロファイリング

この手法は、血漿cfDNAの重亜硫酸塩シーケンシングリードにおいて、各スタンドの5'末端から4bpの長鎖モチーフを同定しようとする。モチーフの階層的クラスタリングは、癌の存在によるこれらのモチーフの過少/過剰表現を検出するために行われる。この手法は、サポートベクターマシンとロジスティック回帰を組み込んでおり、健康な患者から癌患者を予測する。この手法は、クラスタリングと多次元尺度法（MDS）分析を用いて移植患者にも適用され、その適用性が示されている。同じ分析タイプにより、この手法が出生前検査にも適用できることが証明された。この手法は細胞型の起源についても有益な情報を提供する。[ 10 ]

方向性を考慮した血漿遊離DNA断片化分析

この手法は、オープンクロマチン領域におけるシーケンシング深度の不一致と、上流／下流の方向性感受性シーケンシングリード密度から得られるシグナルに基づき、バイサルファイトシーケンシングから得られたcfDNA断片の起源組織を推定します。この手法は、経験的なピーク周期とリードの上流／下流末端の位置に基づいて、方向性を考慮したcfDNA断片化のためのシグナルを生成するための数式を用いています。この手法は、起源組織の推定、妊娠識別、癌検出、移植モニタリングに有用であることが示されています。また、どの起源組織がcfDNAリードにどの程度寄与しているかに関する情報も提供します。[ 11 ]

早期捕捉のための断片のDNA評価

この手法は、 cfDNA断片の長さとカバレッジを考慮しながら、ウィンドウ内の浅いWGSリードを解析します。cfDNA断片化特徴のゲノムワイドパターンは、勾配木ブースティング機械学習モデルに入力され、がんの状況を予測します。また、機械学習分類器を用いて起源組織を予測しました。全体として、この手法は患者ががんに罹患しているかどうかを特定するために使用できます。この手法は予測中にがんの種類を具体的に分類するわけではありませんが、様々ながんの検出に使用されています。[ 15 ]

生体内ヌクレオソームフットプリント

この手法は、生体内ヌクレオソーム占有率のゲノムワイドマッピングを作成し、 cfDNA分子の起源組織を検出する。この手法では、ヌクレオソームコア粒子（NCP）部位に近いと予想されるリードのエンドポイント位置をアラインメントして使用する。ウィンドウ保護スコア（WPS）は、特定の位置を中心とする120塩基対をカバーするcfDNA粒子の頻度から、同じ間隔にエンドポイントを持つ断片の頻度を差し引いて、NCPに近いcfDNA密度を定量化するために提案されている。次に、WPSがフットプリントを識別するために、ピークがヒューリスティックに呼び出される。cfDNAに寄与する細胞は、フットプリントから予測される。これらのフットプリントは、転写因子結合部位などの非悪性エピジェネティックまたは遺伝子部位の特定、および組織損傷と細胞死の程度に基づく悪性腫瘍関連バイオマーカーの検出に使用できる。 [ 17 ]

転写制御プロファイリングにおけるctDNAヌクレオソームパターンの利用

この手法は主に、転移性去勢抵抗性前立腺癌の様々な表現型を検出するために開発されました。さらなる分析のために、患者由来の異種移植片を用いて血液中のctDNAを濃縮する必要があります。WGSの後、この手法ではGriffin [ 39 ]ツールを用いて、ctDNAリードの局所プロモーターカバレッジ、ヌクレオソーム配置、断片サイズ分析、複合転写因子結合部位、およびオープンクロマチン部位を検査します。また、ヒストン修飾をチェックし、発見された部位に次元削減を適用して、推定プロモーター、エンハンサー、および遺伝子抑制ヘテロクロマチンマークを同定します。クロマチン位相、オープンクロマチン領域間の距離を調べるために、この手法ではフーリエ変換とバンドパスフィルターを使用する新開発ソフトウェアTritonNPを使用します。XGBoost [ 40 ]は、前のステップで検出された特徴を用いて癌のサブタイプを分類するために利用されます。[ 41 ]

複数の癌種の早期発見のためのcfDNAメチル化、コピー数、断片化解析

この手法は、 cfDNA全ゲノムメチル化シーケンシングとフラグメントミクス特徴情報の両方を用いて多癌分類を行うアッセイとして提案されている。健常組織と癌組織について算出されたコピー数比は、癌の種類と癌の存在を判別するために使用される。EPIC-seqと同様に、この手法でもフラグメント長を利用する。短いフラグメントと長いフラグメントの比は、この手法では識別スコアとして使用される。検出された癌メチル化マーカーにおける、各癌の種類ごとの単一塩基または領域レベルのメチル化率、コピー数比、および短いフラグメントと長いフラグメントの比を用いて、この手法はカスタムサポートベクターマシンアルゴリズムを用いて、癌の種類が存在する場合に癌の種類を分類する。この手法は、4種類の癌の検出と起源組織を報告する。しかし、癌の種類ごとに特定のメチル化部位／関心領域の検出が必要である[ 42 ]。

参考文献

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