生化学において、フィルター結合アッセイは高分子の結合を研究する方法です。[1] [2]このアッセイでは、結合していない分子と結合している分子の比率を表す数値である結合定数を測定できます。この情報から2つの分子間の親和性が明らかになり、任意の初期条件における結合量を予測することができます。このアッセイは創薬研究においてよく用いられます。[3]
結合定数を測定するには、様々な開始濃度において形成される複合体の量を測定する方法を見つける必要があります。これは、一方の種を蛍光タグ、あるいはこの場合は放射性タグで「標識」することで実現できます。DNAは、アデノシン三リン酸由来の放射性リン酸を添加することで「標識」されます。
説明
フィルター結合アッセイは、フィルターを用いて2つの分子（多くの場合、タンパク質とDNA/RNA）間の親和性を測定する。[4] [5]フィルターは負に帯電したニトロセルロース紙でできている。ほとんどのタンパク質は正に帯電しているため、ニトロセルロース紙はタンパク質を固定化するのに最適である。DNAはリン酸骨格のために負に帯電しており、単独ではニトロセルロースに「付着」しないが、タンパク質に結合したDNAは付着する。ニトロセルロースに「付着」したDNAの正確な量は、シンチレーションカウンターを用いてフィルター上の放射能量を測定することで定量化される。
通常、タンパク質とDNAは、一連の別々の結合反応で混合されます。各反応を通してDNAの量は一定に保たれますが、タンパク質の量は変化します。これらのサンプルは平衡化されます。平衡化後、各反応から等量のサンプルが、真空プレート（下から真空をかけて液体を下方に吸引する平らな面）上に並べられた小さな円形のニトロセルロースフィルター上に付着します。タンパク質はすべて吸着しますが、シンチレーションカウンターにはDNAに結合したタンパク質のみが記録されます。
使用したタンパク質の各濃度に結合した DNA の量を使用して結合曲線をプロットし、結合定数を決定できます。
このアッセイは現在では広く使用されていませんが、迅速かつ簡単で、特定のタンパク質と DNA の相互作用に関する有用かつ詳細な情報を得ることができます。
平衡定数を測定します。
- 標識された DNA をタンパク質とインキュベートします。
- システムが平衡状態に達するまで十分な時間を取ってください。
- 混合物をニトロセルロース製のフィルターディスクで濾過します。タンパク質はニトロセルロースに結合しますが、DNAは結合しません。
- フィルター上に保持される DNA は、タンパク質と相互作用しているために存在します。
- フィルターを乾かして数えます。
オフレートを測定します。
- DNA-タンパク質複合体が結合したフィルターを取ります
- フィルターをバッファーで洗浄する
- 一定時間洗浄した後、フィルター上に残っている DNA の量を定量化します。
オフレートを測定する別の方法:
- 放射性標識DNAとタンパク質を高濃度で一緒に前培養した。
- 0時間目に、混合物は希釈された
- ニトロセルロースフィルターを使用して、様々な時点でアリコートを分析
参考文献
- ^ Korn, Edward D. (2013-04-17). Methods in Membrane Biology: Volume 6. Springer Science & Business Media. p. 220. ISBN 978-1-4757-5817-7. 2025年7月23日閲覧。
- ^ Liu, Dongyou (2024-09-05). 分子バイオテクノロジーハンドブック. CRC Press. p. 308. ISBN 978-1-04-000564-4. 2025年7月23日閲覧。
- ^ マイナー、リサ・K. (2006年1月20日). 創薬アッセイ開発ハンドブック. CRC Press. ISBN 978-1-04-020503-7. 2025年7月23日閲覧。
- ^ スミス、クリストファー WJ (1998-07-09). RNA-タンパク質相互作用：実践的アプローチ. オックスフォード大学出版局, 英国. p. 125. ISBN 978-0-19-159162-4. 2025年7月23日閲覧。
- ^ Moss, Tom (2008-02-02). DNAとタンパク質の相互作用：原理とプロトコル. Springer Science & Business Media. p. 2. ISBN 978-1-59259-208-1. 2025年7月23日閲覧。
