フローサイトメトリーバイオインフォマティクス

フローサイトメトリーバイオインフォマティクスは、バイオインフォマティクスをフローサイトメトリーデータに応用したもので、広範な計算リソースとツールを使用してフローサイトメトリーデータを保存、取得、整理、分析します。フローサイトメトリーバイオインフォマティクスは、計算統計学と機械学習の広範な活用を必要とし、その技術開発に貢献しています。フローサイトメトリーと関連手法により、多数の単一細胞における複数の独立したバイオマーカーの定量化が可能になります。特に2000年代には、フローサイトメトリーデータの多次元性とスループットが急速に向上し、結果を共有するための様々な計算分析手法、データ標準、そして公開データベースが構築されました。

フローサイトメトリーデータの前処理、データ内の細胞集団の同定、サンプル間での細胞集団のマッチング、そして前段階の結果を用いた診断と発見を支援する計算手法が存在します。前処理には、スペクトルの重なりの補正、可視化と解析に適したスケールへのデータ変換、データの品質評価、そしてサンプルと実験間のデータの正規化が含まれます。集団同定に関しては、2次元散布図における従来の手作業による集団同定（ゲーティング）、次元削減を用いたゲーティングの補助、そして様々な方法で高次元空間における集団の自動検出を支援するツールが利用可能です。また、確率ビニングとして知られる密度誘導二値空間分割法やコンビナトリアルゲーティングなど、より包括的な方法でデータを特徴付けることも可能です。最後に、フローサイトメトリーデータを用いた診断は、教師あり学習技術によって支援され、生物学的に重要な新しい細胞種の発見は、前述のすべての手法を統合したパイプラインの一部として、ハイスループット統計手法によって支援されます。

オープン スタンダード、データ、ソフトウェアも、フローサイトメトリー バイオインフォマティクスの重要な要素です。データ スタンダードには、サイトメーターからのデータの保存方法を定義している、広く採用されているフローサイトメトリー スタンダード (FCS) がありますが、実験デザインや分析手順に関するより詳細な情報の保存に役立つ、国際サイトメトリー協会 (ISAC) によって開発中のいくつかの新しいスタンダードもあります。オープン データは、2010 年の CytoBank データベース、および 2012 年の FlowRepository のオープンにより徐々に成長しています。どちらもユーザーはデータを自由に配布でき、FlowRepository は ISAC によって MIFlowCyt 準拠データの推奨リポジトリとして推奨されています。オープン ソフトウェアは、Bioconductorパッケージ スイートの形で最も広く利用できますが、 GenePatternプラットフォームで Web 実行することもできます。

データ収集

フローサイトメーターの概略図。流体シースの焦点合わせ、レーザー、光学系（簡略化されており、焦点合わせは省略）、光電子増倍管（PMT）、アナログ-デジタル変換器、および分析ワークステーションを示しています。

フローサイトメーターは、懸濁された細胞を流体力学的に集束させ、流体の流れの中で互いに分離させることで動作します。この流れは1つまたは複数のレーザーによって走査され、その結果生じる蛍光と散乱光は光電子増倍管によって検出されます。光学フィルターを用いることで、細胞表面または細胞内部の特定の蛍光体を、その発光スペクトルのピークから定量化することができます。これらの蛍光体は、クロロフィルや遺伝子組み換え 緑色蛍光タンパク質などの内因性蛍光体である場合もあれば、タンパク質検出用の抗体やDNAまたはRNA検出用のハイブリダイゼーションプローブなどの検出分子に共有結合した人工蛍光体である場合もあります。

これらを定量化できるため、フローサイトメトリーは、以下を含む幅広い用途で使用されています。

2000年代初頭まで、フローサイトメトリーでは一度に数種類の蛍光マーカーしか測定できませんでした。しかし、1990年代後半から2000年代半ばにかけて、新しい蛍光色素分子が急速に開発され、細胞あたり最大18種類のマーカーを定量できる最新の機器が登場しました。[7] 最近では、マスサイトメトリーという新しい技術により、蛍光色素分子の代わりに飛行時間型質量分析法で検出される希土類元素が使用され、34種類以上のマーカーの発現を測定できるようになりました。[8] 同時に、マイクロ流体qPCR法は、フローサイトメトリーに似た方法で、細胞あたり48種類以上のRNA分子を定量しています。[9] フローサイトメトリーデータの次元数の急速な増加と、数百から数千のサンプルを自動的に分析できるハイスループットロボットプラットフォームの開発により、計算解析手法の改良が求められています。[7]

データ

3つの散乱光チャンネルと13の蛍光チャンネルを備えた装置によるフローサイトメトリーデータの表現。数十万個の細胞のうち最初の30個のみの値を示しています。

フローサイトメトリーデータは、M波長×Nイベントの強度の大きなマトリックス形式で表されます。ほとんどのイベントは特定の細胞に関するものですが、ダブレット（レーザー光を近接して通過する2つの細胞）に関するイベントも存在します。各イベントについて、特定の波長範囲で測定された蛍光強度が記録されます。

測定された蛍光強度は、細胞内の蛍光色素分子の量を示し、これは抗体などの検出分子に結合した量を示します。したがって、蛍光強度は細胞上に存在する検出分子の量の代理指標とみなすことができます。フローサイトメトリーデータを簡略化して（厳密には正確ではありませんが）、M個の測定値×N個の細胞からなる行列として捉えると、各要素は分子の量に対応します。

計算フローサイトメトリーデータ分析の手順

FCM データの分析のためのパイプラインの例と、各ステップに関連する Bioconductor パッケージの一部。

一次 FCM データから疾患診断およびバイオマーカーの発見に移行するプロセスには、次の 4 つの主要なステップが含まれます。

  1. データ前処理（補正、変換、正規化を含む）
  2. 細胞集団の識別（ゲーティングとも呼ばれる）
  3. サンプル間の比較のための細胞集団マッチング
  4. 細胞集団と外部変数の関係（診断と発見）

一部のフローサイトメトリーソフトウェアでは、特定のフローサイトメトリーワークフローにおけるステップの保存がサポートされており、フローサイトメトリー実験の再現性にとって重要です。しかし、保存されたワークスペースファイルはソフトウェア間で互換性がほとんどありません。[10] この問題を解決するための試みとして、Gating-ML XMLベースのデータ標準（標準のセクションで詳細に説明）の開発が行われており、これは市販およびオープンソースのフローサイトメトリーソフトウェアで徐々に採用されつつあります。[11] CytoML Rパッケージも、 FlowJo 、CytoBank、FACS Divaソフトウェアと互換性のあるGating-MLのインポート/エクスポートにより、このギャップを埋めています。

データ前処理

フローサイトメトリーデータは、解析前にアーティファクトや低品質データを除去し、対象となる細胞集団を同定するのに最適なスケールに変換するための前処理を経る必要があります。以下は、典型的なフローサイトメトリー前処理パイプラインの様々なステップです。

補償

複数の蛍光色素を同じレーザーで使用する場合、それらの発光スペクトルはしばしば重なり合います。各蛍光色素は通常、その蛍光色素の発光強度ピークまたはその近傍の狭帯域に設定されたバンドパス光学フィルターを用いて測定されます。その結果、特定の蛍光色素の測定値は、実際にはその蛍光色素のピーク発光強度と、その周波数帯域で重なり合う他のすべての蛍光色素のスペクトル強度の合計となります。この重なりはスピルオーバーと呼ばれ、フローサイトメトリーデータからスピルオーバーを除去するプロセスは補正と呼ばれます。[12]

補正は通常、1種類の蛍光色素のみで染色した一連の代表的なサンプルを流し込み、各蛍光色素が各チャネルに及ぼす影響を測定することによって行われます。[12] 各チャネルから除去する信号の総量は、このデータに基づいて線形方程式を解いてスピルオーバー行列を生成することで計算できます。この行列を逆行列化し、サイトメーターからの生データと掛け合わせると補正データが生成されます。[12] [13] スピルオーバー行列を計算するプロセス、または事前に計算されたスピルオーバー行列を適用してフローサイトメトリーデータを補正するプロセスは、フローサイトメトリーソフトウェアの標準機能です。[14]

変換

フローサイトメトリーで検出された細胞集団は、しばしばほぼ対数正規分布の発現を示すと説明される。[15] そのため、従来は対数スケールに変換されてきた。初期のサイトメーターでは、データ取得前にログアンプを用いてこの変換が行われていた。現代の機器では、データは通常線形形式で保存され、解析前にデジタル変換される。

しかし、補正フローサイトメトリーデータには、補正による負の値が含まれることが多く、平均値が低く正規分布する細胞集団が発生することがあります。[16] 対数変換では負の値を適切に処理できず、正規分布する細胞の種類を適切に表示できません。[16] [17] この問題に対処する代替変換には、対数線形ハイブリッド変換のLogicle [16] [18]とHyperlog [19] 、双曲線逆正弦とBox–Cox [20]などがあります。

一般的に使用されている変換の比較では、双指数変換とボックス・コックス変換が最適にパラメータ化された場合、最も鮮明な視覚化とサンプル間の細胞集団の分散が最小になることが結論付けられました。 [17]しかし、その後、その比較で使用されたflowTransパッケージの比較では、Logicle変換が他の実装と一致する方法でパラメータ化されていないことが示され、その結果に疑問が生じる可能性があります。[21]

品質管理

特に新しいハイスループット実験では、個々のサンプルにおける技術的エラーの検出を支援する可視化手法が求められています。一つのアプローチとして、技術的または生物学的な反復実験の単一次元における経験分布関数などの要約統計量を可視化し、それらの類似性を確認することが挙げられます。[22] より厳密には、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて、個々のサンプルが標準から逸脱しているかどうかを判定することができます。[22]外れ値に対する グラブス検定は、グループから逸脱しているサンプルを検出するために使用できます。

高次元空間における品質管理の方法の一つとして、プールされたデータセット全体にビンを当てはめる確率ビニングがある。[23] 次に、各サンプル内のビンに入るセルの数の標準偏差を多次元類似性の尺度としてとらえ、標準に近いサンプルはより小さな標準偏差を持つ。[23] この方法では、標準偏差が大きいほど外れ値を示す可能性があるが、これは相対的な尺度であり、絶対値はビンの数に部分的に依存する。

これらすべての方法で、サンプル間変動が測定されています。しかし、これは機器や操作によって生じる技術的な変動と、測定したい実際の生物学的情報の組み合わせです。サンプル間変動に対する技術的な要因と生物学的要因の寄与を明確にすることは、困難、あるいは不可能な場合があります。[24]

正規化

特に多施設共同研究では、技術的なばらつきにより、生物学的に同等な細胞集団をサンプル間で一致させることが困難になる場合があります。 そのため、画像位置合わせ技術に起因する技術的なばらつきを除去するための正規化手法は、多くのフローサイトメトリー解析において重要なステップとなります。単一マーカーの正規化は、ランドマーク位置合わせを用いて行うことができます。ランドマーク位置合わせでは、各サンプルのカーネル密度推定値のピークが特定され、サンプル間で位置合わせされます。[24]

細胞集団の特定

選択された3つの次元の3つの組み合わせすべてをカバーする2次元散布図。色は、8つの独立した手動ゲート（多角形）と自動ゲート（色付きの点）のコンセンサスの比較を示しています。手動ゲートとアルゴリズムのコンセンサスは、CLUEパッケージを用いて生成されました。[25]図は[26]から転載。

フローサイトメトリーの生のデータは複雑（数千から数百万の細胞に対して数十回の測定）であるため、統計的検定や教師あり学習を用いて直接質問に答えることは困難です。したがって、フローサイトメトリーデータの解析における重要なステップは、サンプル間で共通する特徴を確立しながら、この複雑さをより扱いやすいレベルまで低減することです。これは通常、機能的および表現型的に均質な細胞群を含む多次元領域を特定することを伴います。[27]これはクラスター分析の一種です。これを実現するには様々な方法があり、以下に詳細を説明します。

ゲーティング

フローサイトメーターによって生成されたデータは、1次元または2次元でプロットし、ヒストグラムや散布図を作成することができます。これらのプロット上の領域は、蛍光強度に基づいて、「ゲート」と呼ばれる一連のサブセット抽出を作成することで、順次分離することができます。これらのゲートは、FlowJo、[28] FCS Express、[29] WinMDI、[30] CytoPaint（別名Paint-A-Gate）、[31] VenturiOne、Cellcion、CellQuest Pro、Cytospec、[32] Kaluza、[33]またはflowCoreなどのソフトウェアを使用して作成できます。

次元数が少なく、サンプル間の技術的および生物学的変動が限られているデータセット（臨床検査室など）では、特定の細胞集団を手動で分析することで、効果的で再現性のある結果が得られます。しかし、高次元データセット内の多数の細胞集団を探索的に分析することは現実的ではありません。[34]さらに、制御の弱い設定（実験室間研究など）での手動分析は、研究全体のエラー率を高める可能性があります。[35]ある研究では、ある程度の変動がある場合、いくつかの計算ゲーティングアルゴリズムが手動分析よりも優れたパフォーマンスを発揮しました。[26]しかし、計算分析が大幅に進歩したにもかかわらず、他の細胞タイプから十分に分離されていない特定の希少細胞集団を同定するための主なソリューションは依然として手動ゲーティングです。

次元削減によるゲーティング

調査が必要な散布図の数は、測定されたマーカーの数の2乗に比例して増加する（または、ほとんどのマーカーで類似しているように見える細胞タイプ間の高次元の違いを解決するために、一部のマーカーは各細胞グループごとに複数回調査する必要があるため、より高速になる）。[36]この問題に対処するために、主成分分析が使用され、すべてのデータポイントの分散を最大化するマーカーの組み合わせを使用して高次元データセットを要約してきた。[37]しかし、PCAは線形手法であり、複雑で非線形な関係を維持することができない。最近では、2次元の最小全域木レイアウトが手動ゲーティングプロセスをガイドするために使用されている。密度ベースのダウンサンプリングとクラスタリングは、希少な集団をより適切に表現し、最小全域木構築プロセスの時間とメモリの複雑さを制御するために使用された。[38]より洗練された次元削減アルゴリズムはまだ研究されていない。[39]

高次元マスサイトメトリーデータセットにおける細胞集団。最小全域木のための2Dレイアウトを用いて次元削減を行った後、手動でゲート処理を行った。図は[40]のデータから転載。

自動ゲート

細胞集団の識別のための計算ツールの開発は、2008 年以降、活発に研究されている分野です。最近では、モデルベースのアルゴリズム (flowClust [41]や FLAME [42]など)、密度ベースのアルゴリズム (FLOCK [43]や SWIFT など)、グラフベースのアプローチ (SamSPECTRAL [44]など)、最近では複数のアプローチのハイブリッド (flowMeans [45]や flowPeaks [46] ) など、多数の個別のクラスタリング手法が開発されています。これらのアルゴリズムは、メモリと時間の複雑さ、ソフトウェア要件、必要な細胞集団の数を自動的に決定する機能、感度と特異性の点で異なります。この分野で研究活動を行っているほとんどの学術グループが積極的に参加している FlowCAP (フローサイトメトリー: 集団識別方法の批判的 評価) プロジェクトでは、最先端の自動分析手法を客観的に比較する方法を提供しています。 [26] [47] [48] [49] [50]

確率ビニング法

flowFP Bioconductorパッケージを用いて作成された周波数差ゲーティングの例。点はFCSファイル内の個々のイベントを表し、四角形はビンを表します。

確率ビニングは、フローサイトメトリーデータを単変量ベースで四分位数に分割する非ゲーティング解析法である。 [51] 次に、四分位数の位置を使用して、カイ二乗検定を用いてサンプル間の差異（分割されていない変数間）を検定することができる。[51]

これは後に、周波数差ゲーティングという形で多次元に拡張されました。これは、データを中央値に沿って反復的に分割するバイナリ空間分割手法です。 [52] これらの分割（またはビン）は、コントロールサンプルに適合されます。そして、テストサンプルにおける各ビンに含まれる細胞の割合を、カイ二乗検定によってコントロールサンプルと比較することができます。

最後に、サイトメトリーフィンガープリンティングでは、周波数差ゲーティングの変種を使用してビンを設定し、一連のサンプルについて各ビンに含まれる細胞の数を測定します。[23]これらのビンはゲートとして使用でき、自動ゲーティング方法と同様に後続の分析に使用できます。

組み合わせゲーティング

高次元クラスタリングアルゴリズムは、他の主要な細胞集団から十分に分離されていない希少な細胞タイプを識別できないことがよくあります。複数のサンプルにわたってこれらの小さな細胞集団をマッチングすることは、さらに困難です。手動分析では、生物学的コントロールなどの事前の生物学的知識が、これらの集団を合理的に識別するためのガイダンスを提供します。しかし、この情報を探索的クラスタリングプロセス（例えば、半教師あり学習）に統合することは、これまで成功していません。

高次元クラスタリングの代替として、一度に1つのマーカーを用いて細胞集団を識別し、それらを組み合わせて高次元クラスターを生成する方法があります。この機能はFlowJoで初めて実装されました。[28] flowTypeアルゴリズムは、マーカーの除外を可能にすることで、このフレームワークを基盤としています。[53]これにより、各マーカーの重要性を調査し、高次元の冗長性を排除できる統計ツール（例：RchyOptimyx）の開発が可能になります。[54]

診断と発見

HIV防御の相関因子を特定するためのflowType/RchyOptimyxパイプラインの概要：まず、1次元パーティションを組み合わせることで数万個の細胞集団を特定します（パネル1）。次に、統計的検定（および多重検定補正のためのボンフェローニ法）を用いて細胞集団を分析し、生存情報と相関する細胞集団を特定します。3番目のパネルは、その細胞集団をゲーティングするためのすべての可能な戦略を記述した完全なゲーティング階層を示しています。このグラフから「最適な」ゲーティング戦略（つまり、最も重要なマーカーが早期に出現する戦略）を特定することができます。選択されたすべての表現型に対するこれらの階層は、パネル4に示されています。パネル5では、これらの階層が1つのグラフに統合され、データセット全体を要約し、各表現型に関与するマーカーの数と臨床転帰との相関の有意性（例えば、パネル6のカプラン・マイヤー推定値によって測定される）との間のトレードオフを示しています。図は[53]およびから一部転載。[54]

対象となる細胞集団を同定した後、クロスサンプル解析を実施することで、外部変数（例えば臨床転帰）と相関する表現型または機能的変異を特定することができます。これらの研究は、主に以下の2つのグループに分けられます。

診断

これらの研究の目標は通常、1つまたは複数の細胞集団の変異を用いて疾患（または疾患のサブクラス）を診断することです。例えば、多次元クラスタリングを用いてクラスターセットを識別し、それらを全サンプル間でマッチングさせた後、教師あり学習を用いて対象クラスの予測のための分類器を構築することができます（例えば、このアプローチは特定のリンパ腫サブタイプの分類精度を向上させるために使用できます[55]）。あるいは、コホート全体のすべての細胞を単一の多次元空間にプールし、分類前にクラスタリングを行うこともできます[56] 。このアプローチは、生物学的変異の量が多いデータセット（サンプル間のマッチングが困難）に特に適していますが、技術的な変異を慎重に管理する必要があります[57] 。

発見

探索的解析においては、外部変数と相関する細胞集団を同定し、記述することが目標です（診断的解析では、複数の細胞タイプの予測力を組み合わせて結果の精度を最大化することが目標ですが、これとは対照的です）。診断ユースケースと同様に、高次元空間におけるクラスターマッチングは探索的解析に使用できますが、高次元空間では次元を縮小せずに細胞集団を特徴付け、視覚化することが難しいため、このアプローチの記述力は非常に限られています。[56] [58]最後に、コンビナトリアルゲーティングアプローチは、FCMデータの探索的解析において特に成功を収めています。Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations (SPICE) は、FlowJoのゲーティング機能を使用して、幅広い異なる細胞集団を統計的に評価し、外部アウトカムと相関する細胞集団を視覚化できるソフトウェアパッケージです。flowTypeとRchyOptimyx（上記参照）は、独立したマーカーが外部アウトカムとの全体的な相関に与える影響を調査する機能を追加することで、この手法を拡張しています。これにより、不要なマーカーを除去し、識別されたすべての細胞タイプを簡潔に視覚化することができます。最近行われた大規模（n=466）HIV陽性患者コホートの解析では、このパイプラインによってHIVに対する防御の相関因子が3つ特定されましたが、そのうち1つだけが、以前に同じデータセットの広範な手動解析によって特定されていました。[53]

データ形式と交換

フローサイトメトリー標準

フローサイトメトリー標準 (FCS) は、フローサイトメトリーデータの記録と共有を可能にするために 1984 年に開発されました。[59]それ以来、FCS はすべてのフローサイトメトリーソフトウェアおよびハードウェアベンダーによってサポートされる標準ファイル形式になりました。FCS 仕様は、伝統的に国際サイトメトリー振興協会 (ISAC) によって開発および保守されています。[60]長年にわたり、フローサイトメトリーとコンピューティング技術の両方の技術的進歩に適応するために更新が取り入れられ、1990 年に FCS 2.0 が導入され、[61] 1997 年に FCS 3.0、[62]最新仕様の FCS 3.1 がリリースされました。 [63] FCS はかつて、フローサイトメトリーで唯一広く採用されているファイル形式でした。

ネットCDF

ISACは、FCSをフローサイトメトリー専用バージョンのNetwork Common Data Form (netCDF)ファイル形式に置き換えることを検討しています。[64] netCDFは、アレイ指向の科学データの作成、アクセス、共有をサポートする、無料で利用可能なソフトウェアライブラリとマシンに依存しないデータ形式のセットです。2008年、ISACはフローサイトメトリーの生データの保存のためのnetCDF規約の最初のバージョンを策定しました。[65]

アーカイブサイトメトリー標準（ACS）

アーカイバルサイトメトリー標準（ACS）は、サイトメトリー実験を記述する様々なコンポーネントとデータをバンドルするために開発されています。[66]データ、メタデータ、分析ファイル、その他のコンポーネント間の関係をキャプチャし、監査証跡、バージョン管理、デジタル署名のサポートが含まれています。ACSコンテナは、コンテナ内のファイル間の関係を指定するXMLベースの目次を備えたZIPファイル形式に基づいています。ACSコンテナ内のコンポーネントのデジタル署名を可能にするために、 XML署名W3C勧告が採用されています。ACSの初期ドラフトは2007年に設計され、2010年に完成しました。それ以来、FlowJoやCytobankなど、いくつかのソフトウェアツールにACSサポートが導入されています。

ゲーティングML

ゲーティングの相互運用性の欠如は、従来、フローサイトメトリーデータ解析の再現性と複数の解析ツールの使用を妨げるボトルネックとなっていました。この欠点に対処するために、ISACはゲートと関連するデータ（スケール）変換を正式に記述するXMLベースのメカニズムであるGating-MLを開発しました。[10] Gating-MLのドラフト勧告版は2008年にISACによって承認され、FlowJo、flowUtils、R/BioConductorのCytoMLライブラリ、FlowRepositoryなどのツールによって部分的にサポートされています。[66]これは、長方形ゲート、ポリゴンゲート、凸多面体、楕円体、決定木、および他のタイプのゲートのブールコレクションをサポートしています。さらに、サイトメトリーデータの表示や解析に潜在的に有用であることが示されている数十の組み込みの公開変換が含まれています。2013年に、Gating-MLバージョン2.0はISACのデータ標準タスクフォースによって勧告として承認されました。この新しいバージョンでは、ゲーティング記述の柔軟性は若干劣りますが、ソフトウェアツールでの実装も大幅に容易になっています。[11]

分類結果（CLR）

分類結果（CLR）ファイル形式[67]は、手動ゲーティングとアルゴリズム分類アプローチの結果を標準的な方法で交換し、分類を報告および処理できるようにするために開発されました。CLRは、一般的にサポートされているCSVファイル形式に基づいており、異なるクラスに対応する列と、イベントが特定のクラスのメンバーである確率を含むセル値が含まれています。これらは0から1までの値として取得されます。形式のシンプルさと一般的なスプレッドシートツールとの互換性が、仕様設計を推進する主要な要件でした。もともとフローサイトメトリーの分野向けに設計されましたが、事実上あらゆる種類のオブジェクトのあいまい分類または明確な分類を取得する必要があるあらゆる分野に適用できます。

公開データとソフトウェア

他のバイオインフォマティクス分野と同様に、新しい手法の開発は主に無料のオープンソースソフトウェアの形をとっており、オープンデータを保管するためのデータベースがいくつか作成されています。

オートゲート

AutoGate [68]は、補正、ゲーティング、クラスターのプレビュー、網羅的投影追跡（EPP）、多次元スケーリング、フェノグラムを実行し、HiDの準備状態を表す視覚的なデンドグラムを作成します。学術機関、政府機関、非営利団体の研究者および臨床医は無料で利用できます。

バイオコンダクター

Bioconductorプロジェクトは、主にRプログラミング言語で書かれた無料のオープンソースソフトウェアのリポジトリです。[69] 2013年7月現在、Bioconductorにはフローサイトメトリーデータを処理するためのソフトウェアパッケージが21個含まれています。[70] これらのパッケージは、この記事で前述した機能のほとんどをカバーしています。

遺伝子パターン

GenePatternは、遺伝子発現、プロテオミクス、その他のデータ解析のための200以上のツールを備えた、主にゲノム解析プラットフォームです。Webベースのインターフェースにより、これらのツールに簡単にアクセスでき、再現性の高い研究を可能にする自動解析パイプラインを作成できます。最近、プログラミングスキルを持たない実験者にも高度なフローサイトメトリーデータ解析ツールを提供するために、GenePattern Flow Cytometry Suiteが開発されました。このスイートには、フローサイトメトリー標準ファイル（FCSファイル）の基本的な処理から、細胞集団の自動識別、正規化、品質評価のための高度なアルゴリズムまで、約40のオープンソースGenePatternフローサイトメトリーモジュールが含まれています。これらのモジュールのほとんどは、BioConductorで開発された機能を活用しています。

フローサイトメトリー解析用のBioconductorパッケージの機能の多くは、GenePattern [71] ワークフローシステムで使用するために、GenePattern Flow Cytometry Suiteの形でパッケージ化されています。[72]

FACSanadu

FACSanadu [73]は、FCSデータの可視化と解析のためのオープンソースのポータブルアプリケーションです。Bioconductorとは異なり、非プログラマーが日常的な解析を行えるように設計された対話型プログラムです。標準的なFCSファイルに加え、COPASプロファイルデータもサポートしています。

ヘマト

hema.toは、リンパ腫が疑われる患者のフローサイトメトリーデータを分類するためのウェブサービスです。[74]このツールに搭載されている人工知能は、深層畳み込みニューラルネットワークを用いて、異なるサブタイプのパターンを認識します。すべてのデータとコードはオープンアクセスです。[75]生データを処理するため、ゲーティングは不要です。新しいデータで最高のパフォーマンスを得るには、知識移転による微調整が必​​要です。[76]

公開データベース

フローサイトメトリー実験に関する最小限の情報（MIFlowCyt）では、出版物で使用されるフローサイトメトリーデータはすべて公開されている必要がありますが、公開データベースへの登録は必須ではありません。[77] そのため、Cytometry Part AおよびB誌、そしてNature Publishing GroupのすべてのジャーナルはMIFlowCytへの準拠を義務付けていますが、公開されているフローサイトメトリーデータは依然として比較的少ないのが現状です。しかしながら、公開データベースの構築に向けた取り組みはいくつか行われています。

まず、完全なウェブベースのフローサイトメトリーデータ保存・分析プラットフォームであるCytoBankが、限定的な形で一般に公開されました。[78] CytoBankのコードベースを使用して、2012年にISACの支援を受けてFlowRepositoryが開発され、フローサイトメトリーデータの公開リポジトリとなりました。[79] FlowRepositoryはMIFlowCytへの準拠を容易にし、[80] 2013年7月時点で65の公開データセットを含んでいます。[81]

データセット

2012年、フローサイトメトリーコミュニティは、公開データセットのリリースを開始しました。既存のデータ分析の課題を表すこれらのデータセットのサブセットを以下に説明します。手動ゲーティングとの比較のために、FlowCAP-Iプロジェクトは、人間のアナリストによって手動でゲーティングされた5つのデータセットと、8人の独立したアナリストによってゲーティングされた2つのデータセットをリリースしました。[26] FlowCAP-IIプロジェクトには、バイナリ分類用の3つのデータセットが含まれており、これらのサンプルを完全に分類できるいくつかのアルゴリズムも報告されています。FlowCAP-IIIには、手動ゲートとの比較用の2つのより大きなデータセットと、より困難なサンプル分類データセットが1つ含まれています。2013年3月現在、FlowCAP-IIIの公開リリースはまだ進行中でした。[82] FlowCAP-I、II、IIIで使用されるデータセットは、被験者数またはパラメータ数が少ないです。しかし、最近、14のパラメータアッセイと生存分析に十分な臨床情報の両方を提供する466人のHIV感染者のデータセットなど、より複雑な臨床データセットがいくつかリリースされました。[54] [83] [84] [85]

もう一つのデータセットは、高次元マスサイトメトリーアッセイです。このデータセットの代表的な例としては、2つの骨髄サンプルを30種類以上の表面マーカーまたは細胞内マーカーを用いて、様々な刺激条件下で解析した研究があります。[8]このデータセットの生データは、原稿に記載されているとおり公開されており、表面マーカーの手動解析は著者からのリクエストに応じて入手可能です。

未解決の問題

フローサイトメトリーバイオインフォマティクスの分野は急速に発展していますが、解決すべき問題がいくつか残っています。

フローサイトメトリー実験におけるばらつきは、サンプル間の生物学的ばらつき、使用される機器間の技術的ばらつき、そして分析方法に起因する。2010年、スタンフォード大学と国立衛生研究所の研究者グループは、技術的なばらつきはサンプルの取り扱い、機器のセットアップ、試薬の選択を標準化することで改善できるものの、分析方法におけるばらつきを解決するには、ゲーティング方法の同様の標準化と計算自動化が必要であると指摘した。[86] さらに、データと分析の両方を一元化することで、実験間のばらつきを低減し、結果を比較しやすくなる可能性があると彼らは述べている。[86]

パシフィックバイオサイエンスとスタンフォード大学の研究者による別のグループもこれに同調し、クラウドコンピューティングによってフローサイトメトリー実験の集中化、標準化、高スループット分析が可能になると示唆した。[87] また、標準データ形式の継続的な開発と採用が、実験間のばらつきの低減に引き続き役立つ可能性があると強調した。[87] また、高スループット分析の結果を生物学者が解釈できる方法でモデル化および要約するための新しい方法が必要であると提案した。[87]大規模なフローサイトメトリーデータを、遺伝子発現、遺伝子変異、代謝物レベル、疾患状態などの他の高スループット生物学的情報と統合する方法も必要になるだろうと提案した。[87]

参照

参考文献

この記事は、以下の出典をCC BY 4.0ライセンス（2013年）（査読者レポート）に基づき改変したものです： Kieran O'Neill、Nima Aghaeepour、Josef Spidlen、Ryan Brinkman（2013年12月5日）。「フローサイトメトリーバイオインフォマティクス」。PLOS Computational Biology 9 (12): e1003365. doi : 10.1371/JOURNAL.PCBI.1003365 . ISSN  1553-734X. PMC 3867282.  PMID 24363631.  Wikidata Q21045422  .{{cite journal}}: CS1 maint: 記事番号をページ番号として表示 (リンク)

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