蛍光干渉コントラスト顕微鏡

蛍光干渉コントラスト (FLIC) 顕微鏡は、ナノメートル スケールの Z 解像度を実現するために開発された 顕微鏡技術です。

FLICは、蛍光体が反射面（例えばSiウェハ）の近くにある場合に発生します。直射光と反射光が干渉することで、蛍光体の強度Iは反射面からの距離hの関数として、二重sin 2変調されます。これにより、ナノメートル単位の高さ測定が可能になります。

FLIC 顕微鏡は、人工脂質二重層、生細胞膜、または表面上の 蛍光標識タンパク質の構造など、蛍光プローブを含む膜のトポグラフィーを測定するのに適しています。

FLICの光学理論

一般的な2層システム

FLICの基礎となる光学理論は、アーミン・ランバッハーとピーター・フロムヘルツによって開発されました。彼らは、観測された蛍光強度と、反射シリコン表面 からの蛍光体の距離との関係を導き出しました

観測される蛍光強度 は、単位時間あたりの励起確率と、単位時間あたりに放出された光子を測定する確率の積です。 両方の確率は、シリコン表面からの蛍光体の高さの関数であるため、観測される強度も蛍光体の高さの関数になります。 考えられる最も単純な配置は、シリコン (屈折率 ) とのインターフェースから距離dのところにある二酸化シリコン (屈折率 ) に蛍光体が埋め込まれている場合です。蛍光体は波長 の光によって励起され、波長 の光を放出します。単位ベクトル は、蛍光体の励起 遷移双極子の方向を与えます。 は、局所電場の二乗投影に比例します。これには、干渉が遷移双極子の方向に 及ぼす影響が含まれます。蛍光体における局所 電場 は、直接入射光とシリコン表面で反射した光との干渉の影響を受けます。干渉は、次式で与えられる 位相差によって定量化されます。 は、シリコン面の法線に対する入射光の角度です。干渉は を変調するだけでなく、シリコン表面は入射光を完全には反射しません。フレネル係数は、入射波と反射波の振幅の変化を与えます。フレネル係数は、入射角、および、2 つの媒体の屈折率、および偏光方向に依存します。角度と は、スネルの法線によって関連付けられます。反射係数の式は次のとおりです。TE は入射面 に垂直な電場の成分、TM は平行な成分を指します (入射面は、面法線と光の伝播方向によって定義されます)。直交座標では、局所電場は、 入射面に対する入射光の偏光角です。励起双極子の方向は、法線に対する角度と入射面に対する方位角の関数です。 上記の および の 2 つの式を組み合わせると、単位時間あたりに蛍光体が励起される確率を与えることができます。私FL私C{\displaystyle I_{FLIC}}Pe×{\displaystyle P_{ex}}Pem{\displaystyle P_{em}}n1{\displaystyle n_{1}}n0{\displaystyle n_{0}}λe×{\displaystyle \lambda_{ex}}λem{\displaystyle \lambda_{em}}″ee×″{\displaystyle ''e_{ex}''}Pe×{\displaystyle P_{ex}}F私n{\displaystyle F_{in}}Pe×∝ ∣F私n⋅ee×∣2{\displaystyle P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}F私n{\displaystyle F_{in}}Φ私n{\displaystyle \Phi_{in}}Φ私n＝4πn1dcos⁡θ1私nλe×{\displaystyle \Phi_{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta_{1}^{in}}{\lambda_{ex}}}}θ1私n{\displaystyle \theta_{1}^{in}}F私n{\displaystyle F_{in}}θ私{\displaystyle \theta_{i}}θj{\displaystyle \theta_{j}}θ私{\displaystyle \theta_{i}}θj{\displaystyle \theta_{j}}r私jTE＝n私cos⁡θ私−njcos⁡θjn私cos⁡θ私＋njcos⁡θjr私jTM＝njcos⁡θ私−n私cos⁡θjnjcos⁡θ私＋n私cos⁡θj{\displaystyle r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}}F私n＝sin⁡γ私n[01＋r10TEe私Φ私n0]＋cos⁡γ私n[cos⁡θ1私n（1−r10TMe私Φ私n）0sin⁡θ1私n（1＋r10TMe私Φ私n）]{\displaystyle F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]}γ私n{\displaystyle \gamma_{in}}θe×{\displaystyle \theta_{ex}}ϕe×{\displaystyle \phi_{ex}}ee×＝[cos⁡ϕe×sin⁡θe×sin⁡ϕe×sin⁡θe×cos⁡θe×]{\displaystyle {\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]}F私n{\displaystyle F_{in}}ee×{\displaystyle {\textit {e}}_{ex}}Pe×{\displaystyle P_{ex}} 上記で使用したパラメータの多くは、通常の実験では変動します。以下の5つのパラメータの変動も、この理論的説明に含める必要があります。

  • 励起光のコヒーレンス
  • 励起光の入射角（ ）θ1私n{\displaystyle \theta_{1}^{in}}
  • 励起光の偏光角（ ）γ私n{\displaystyle \gamma_{in}}
  • 蛍光体の遷移双極子角（ ）θe×{\displaystyle \theta_{ex}}
  • 励起光の波長（）λe×{\displaystyle \lambda_{ex}}

励起確率を求めるには、これらの量の二乗投影を平均化する必要がある。最初の4つのパラメータを平均化すると、 ∣F私n⋅ee×∣2{\displaystyle \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}Pe×{\displaystyle P_{ex}}<∣F私n⋅ee×∣2>∝∫sin⁡θ1私ndθ1私nA私n（θ1私n）×∫sin⁡θe×dθe×O（θe×）Ue×（λ私n、θ1私n。θe×）{\displaystyle <\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})}Ue×＝sin2⁡θe×∣1＋r10TEe私Φ私n∣2＋sin2⁡θe×cos2⁡θ1私n∣1−r10TMe私Φ私n∣2＋2cos2⁡θe×sin2⁡θ1私n∣1＋r10TMe私Φ私n∣2{\displaystyle U_{ex}=\sin^{2}\theta_{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi_{in}}\mid ^{2}+\sin^{2}\theta_{ex}\cos^{2}\theta_{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi_{in}}\mid ^{2}+2\cos^{2}\theta_{ex}\sin^{2}\theta_{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi_{in}}\mid ^{2}}

FLIC強度プロットの例。測定された相対蛍光強度と蛍光体から反射面までの距離の関係を示しています。実際の実験プロットでは、ピークの高さは必ずしも同じではありません。

正規化係数は含まれていません。 は蛍光体双極子の配向角の分布です。方位角と偏光角は解析的に積分されるため、上記の式には現れません。最終的に単位時間あたりの励起確率を得るには、蛍光体の強度と消衰係数を考慮して、上記の式を励起波長の広がりにわたって積分します。 計算手順は、パラメータラベルemをexに、inをoutに置き換えることを除いて、上記の計算手順と同じです。 測定された蛍光強度は、励起確率と発光確率の積に比例します。 O（θe×）{\displaystyle O(\theta _{ex})}ϕe×{\displaystyle \phi_{ex}}γ私n{\displaystyle \gamma_{in}}私（λe×）{\displaystyle I(\lambda _{ex})}ϵ（λe×）{\displaystyle \epsilon (\lambda _{ex})}Pe×∝∫dλe×私（λe×）ϵ（λe×）<∣F私n⋅ee×∣2＞{\displaystyle P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}Pem{\displaystyle P_{em}}Pe×{\displaystyle P_{ex}}Pem∝∫dλemΦdet（λem）f（λem）<∣F私n⋅ee×∣2＞{\displaystyle P_{em}\propto \int d\lambda _{em}\Phi _{det}(\lambda _{em}){\textit {f}}(\lambda _{em})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}

私FL私C∝Pe×Pem{\displaystyle I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}} この理論では、測定された蛍光強度と蛍光体から反射面までの距離との間に比例関係が成立すると定義されています。この関係が等式ではないという事実は、実験手順に大きな影響を与えます。 私FL私C{\displaystyle I_{FLIC}}

実験セットアップ

FLIC実験では、通常、シリコンウエハーが反射面として使用されます。次に、スペーサーとして機能するように、シリコンウエハー上に熱酸化層を成長させます。酸化物の上に、脂質膜、細胞、膜結合タンパク質などの蛍光標識標本を配置します。サンプルシステムが構築されたら、定量的な強度測定を行うために必要なのは、 落射蛍光顕微鏡とCCDカメラだけです

これは、シリコン、3 つの酸化物層、蛍光標識脂質二重層 (黄色の星は蛍光体を表します) を使用した FLIC 実験セットアップの例の図です。

二酸化ケイ素の厚さは、正確な FLIC 測定を行う上で非常に重要です。前述のように、理論モデルは、測定された相対的な蛍光強度と蛍光体の高さの関係を表します。蛍光体の位置は、測定された単一の FLIC 曲線から単純に読み取ることはできません。基本的な手順は、少なくとも 2 つの既知の厚さを持つ酸化物層を製造することです (層はフォトリソグラフィー技術で作成し、厚さはエリプソメトリーで測定できます)。使用する厚さは、測定対象のサンプルによって異なります。蛍光体の高さが 10 nm 程度のサンプルの場合、酸化物の厚さは約 50 nm が最適です。これは、FLIC 強度曲線がこの厚さで最も急峻になり、蛍光体の高さ間のコントラストが最大になるからです。酸化物の厚さが数百ナノメートルを超えると、曲線が多色光とさまざまな入射角によってぼやけ始めるため、問題が発生する可能性があります。異なる酸化物の厚さで測定された蛍光強度の比を予測比と比較することで、酸化物上の蛍光体の高さ ( ) を計算します。 上記の式を数値的に解くと が得られます。実験の不完全性、例えば不完全な反射、光の非垂直入射、多色光などは、シャープな蛍光曲線をぼかす傾向があります。入射角の広がりは、開口数（NA）によって制御できます。しかし、使用する開口数に応じて、実験では良好な横方向分解能（xy）または垂直方向分解能（z）が得られますが、両方が得られるわけではありません。高いNA（約1.0）は良好な横方向分解能をもたらし、長距離トポグラフィーの測定に最適です。一方、低いNA（約0.001）は、システム内の蛍光標識分子の高さを測定するための正確なz方向高さ測定を提供します。 df、{\displaystyle d_{\textit {f}},}私theory（d1）私theory（d0）＝私e×p（d1＋df）私e×p（d0＋df）{\displaystyle {\frac {I_{理論}(d_{1})}{I_{理論}(d_{0})}}={\frac {I_{exp}(d_{1}+d_{\textit {f}})}{I_{exp}(d_{0}+d_{\textit {f}})}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}

分析

16段階の酸化物の厚さにわたって蛍光標識されたサンプルについて収集された実験データの例。16のデータポイントに曲線を当てはめると、酸化物表面からの蛍光体の高さが得られます

基本的な解析では、強度データを理論モデルにフィッティングし、酸化物表面からの蛍光体の距離 ( ) を自由パラメータとします。酸化物からの蛍光体の距離が増加すると、FLIC 曲線は左に移動します。 は通常は対象のパラメータですが、フィッティングを最適化するために他のいくつかの自由パラメータが含まれることがよくあります。通常は、振幅係数 (a) と背景の定数項 (b) が含まれます。振幅係数は相対モデル強度を調整し、一定の背景は曲線を上下にシフトさせて、セルの上面など焦点外の領域から来る蛍光を考慮します。場合によっては、顕微鏡の開口数 (NA) をフィッティングの自由パラメータとして使用できます。異なる屈折率、層の厚さ、光の波長など、光学理論に含まれるその他のパラメータは、ある程度の不確実性を伴う一定であると想定されます。FLIC チップは、9 または 16 の異なる高さの酸化物テラスをブロック状に配置して作成できます。蛍光画像が撮影されると、9 または 16 段の段々畑のブロックごとに、固有の を定義する個別の FLIC 曲線が生成されます。平均は、すべての値をヒストグラムにコンパイルすることで求められます。 の計算における 統計誤差は、光学理論をデータに適合させる際の誤差と、酸化層の厚さの不確実性の 2 つの原因から生じます。 系統的誤差は、酸化層の厚さの測定 (通常はエリプソメーターを使用)、CCD による蛍光強度の測定、および光学理論で使用されるパラメータの不確実性の 3 つの原因から生じます。系統的誤差は と推定されています。 df{\displaystyle d_{\textit {f}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}df{\displaystyle d_{\textit {f}}}〜1nm{\displaystyle \sim 1nm}

参考文献

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