| 頭字語 | CE |
|---|---|
| 分類 | 電気泳動 |
| 分析対象物 | 生体分子キラル分子 |
| その他の技術 | |
| 関連している | ゲル電気泳動二次元ゲル電気泳動 |
| ハイフン付き | キャピラリー電気泳動質量分析法 |
キャピラリー電気泳動(CE)は、サブミリメートル径のキャピラリーやマイクロ・ナノ流体チャネルで行われる電気動電学的分離法の一種です。CEはキャピラリーゾーン電気泳動(CZE)を指すことが多いですが、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)、キャピラリー等電点電気泳動(CIEF)、キャピラリー等速電気泳動、ミセル電気動電クロマトグラフィー(MEKC)などの他の電気泳動技術もこのクラスの方法に属します。[ 1 ] CE法では、分析対象物質は電界の影響下で電解質溶液中を移動します。分析対象物質は、イオン移動度や非共有結合による交互相への分配に応じて分離できます。さらに、導電率やpHの勾配によって分析対象物質を濃縮(「フォーカス」)することもできます。

キャピラリー電気泳動を実行するために必要な機器は比較的単純です。キャピラリー電気泳動システムの基本図を図 1に示します。システムの主なコンポーネントは、サンプルバイアル、ソースバイアルとデスティネーションバイアル、キャピラリー、電極、高電圧電源、検出器、およびデータ出力および処理装置です。ソースバイアル、デスティネーションバイアル、キャピラリーには、水性緩衝液などの電解質が満たされています。サンプルを導入するには、キャピラリー入口をサンプルの入ったバイアルに挿入します。サンプルは、毛細管現象、圧力、サイフォン、または電気動電によってキャピラリーに導入され、その後、キャピラリーはソースバイアルに戻されます。分析対象物質の移動は、ソースバイアルとデスティネーションバイアルの間に印加され、高電圧電源によって電極に供給される電界によって開始されます。CE の最も一般的なモードでは、正イオンと負イオンの両方が、電気浸透流によって同じ方向にキャピラリーを通って引き込まれます。分析対象物質は、電気泳動移動度により移動する際に分離し、キャピラリーの出口端付近で検出されます。検出器の出力は、積分器やコンピュータなどのデータ出力および処理装置に送られます。データは、時間の関数として検出器の応答を報告する電気泳動図として表示されます。分離された化合物は、電気泳動図内で異なる移動時間を持つピークとして現れます。[ 2 ]この技術は、この技術の機能を初めて実証したJames W. Jorgensenと Krynn DeArman Lukacs に帰属することが多いとされています。 [ 3 ]キャピラリー電気泳動は、 Richard D. Smithと同僚によって初めて質量分析法と組み合わせられ、非常に小さなサンプルサイズの分析に極めて高い感度を提供します。サンプルサイズが非常に小さいにもかかわらず (通常、キャピラリーに導入される液体はわずか数ナノリットル)、高感度と鋭いピークが達成されるのは、分析対象物質をキャピラリーの入口付近の狭い領域に集中させる注入戦略によるところが大きいです。これは、加圧注入法または電気泳動注入法のいずれの場合も、サンプルをランニングバッファーよりも導電率の低いバッファー(例えば、塩濃度の低いバッファー)に懸濁するだけで実現できます。フィールド増幅サンプルスタッキング(等速電気泳動法の一種)と呼ばれるプロセスは、)により、低導電率のサンプルと高導電率のランニングバッファーとの境界にある狭い領域に分析対象物が集中することになります。
サンプルスループットを向上させるため、キャピラリーアレイを備えた装置を用いて、多数のサンプルを同時に分析します。16本または96本のキャピラリーを備えたこのようなキャピラリーアレイ電気泳動(CAE)装置は、中~高スループットのキャピラリーDNAシーケンシングに用いられ、キャピラリーの入口端は空間的にアレイ化されており、SBS標準フットプリントの96ウェルプレートから直接サンプルを受容します。装置の特定の側面(検出など)は、必然的に単一キャピラリーシステムよりも複雑になりますが、設計と動作の基本原理は図1に示すものと同様です。
キャピラリー電気泳動による分離は、いくつかの検出装置で検出できます。市販されているシステムの大部分は、UVまたはUV-Vis吸光度を主な検出モードとして用いています。これらのシステムでは、キャピラリー自体の一部が検出セルとして使用されます。チューブ内検出を用いることで、分離した分析対象物を分解能を損なうことなく検出できます。一般的に、キャピラリー電気泳動に使用されるキャピラリーは、柔軟性を高めるためにポリマー(多くの場合、ポリイミドまたはテフロン)でコーティングされています。しかし、UV検出に使用されるキャピラリー部分は光学的に透明でなければなりません。ポリイミドコーティングされたキャピラリーの場合、コーティングの一部を焼却または削り取り、数ミリメートルの長さの露出窓を設けます。キャピラリーのこの露出部分は破損しやすいため、セル窓の安定性を高めるために透明コーティングされたキャピラリーが利用可能です。キャピラリー電気泳動における検出セルの光路長(約50マイクロメートル)は、従来のUVセルの光路長(約1cm )よりもはるかに短くなっています。ランバート・ベールの法則によれば、検出器の感度はセルの光路長に比例します。感度を向上させるには光路長を長くしますが、分解能が低下します。キャピラリーチューブ自体を検出点で拡張して光路長の長い「バブルセル」を作成するか、図2に示すように検出点にチューブを追加することができます。しかし、どちらの方法でも分離分解能は低下します。[ 4 ]加熱と加圧によってキャピラリー壁に滑らかな動脈瘤を形成すれば、プラグフローを維持できるため、この分解能の低下はほとんど目立ちません。ゲイリー・ゴードンによるこの発明(米国特許第5061361号)は、通常、吸光光路長を3倍にします。UV吸光度検出器と併用すると、セル内の分析対象物質の断面積が広くなるため、照射ビームが2倍になり、ショットノイズが2分の1に減少します。これら2つの要素を組み合わせることで、アジレント・テクノロジーのバブルセルCE検出器の感度は、ストレートキャピラリーを用いた検出器の6倍に向上します。このセルとその製造方法については、1995年6月号のHewlett-Packard Journal 62ページに記載されています。

キャピラリー電気泳動では、自然に蛍光を発するサンプルや化学的に修飾されて蛍光タグを含むサンプルに対して蛍光検出を使用することもできます。この検出モードは、これらのサンプルに対して高感度で選択性が向上しますが、蛍光を発しないサンプルには使用できません。タンパク質やDNAなどの非蛍光分子の蛍光誘導体または複合体を作成するために、さまざまな標識戦略が使用されています。キャピラリー電気泳動システムでの蛍光検出のセットアップは複雑になる場合があります。この方法では、光線をキャピラリーに集中させる必要がありますが、多くの光源では難しい場合があります。[ 4 ]レーザー誘起蛍光は、10 −18~ 10 −21モルという低い検出限界でCEシステムで使用されています。この技術の感度は、入射光の高い強度と、光を正確にキャピラリーに集中させる能力に起因しています。[ 2 ] 多色蛍光検出は、複数の二色ミラーとバンドパスフィルターを用いて蛍光発光を複数の検出器(例えば光電子増倍管)に分離するか、プリズムや格子を用いてスペクトル分解された蛍光発光をCCDアレイなどの位置感度検出器に投影することで実現できます。4色および5色のLIF検出システムを備えたCEシステムは、キャピラリーDNAシーケンシングおよび遺伝子型判定(「DNAフィンガープリンティング」)アプリケーションに日常的に使用されています。[ 5 ] [ 6 ]
試料成分の同定には、キャピラリー電気泳動を質量分析計または表面増強ラマン分光法(SERS)と直接組み合わせる方法があります。ほとんどのシステムでは、キャピラリー出口はエレクトロスプレーイオン化(ESI)を利用するイオン源に導入されます。生成されたイオンは質量分析計で分析されます。この構成では揮発性緩衝液が必要であり、使用可能な分離モードの範囲と達成可能な分解能に影響を与えます。[ 4 ] 測定と分析は、ほとんどの場合、専用の機器を用いて行われます。
CE-SERSでは、キャピラリー電気泳動溶出液をSERS活性基板上に堆積させることができます。キャピラリー電気泳動中にSERS活性基板を一定速度で移動させることで、分析対象物質の保持時間を空間距離に変換できます。これにより、後続の分光法を特定の溶出液に適用し、高感度で同定することが可能になります。SERS活性基板は、分析対象物質のスペクトルを妨害しないものを選択できます。[ 7 ]
キャピラリー電気泳動による化合物の分離は、印加電界中における分析対象物質の差動移動に依存する。反対電荷の電極に向かう分析対象物質の 電気泳動速度( )は、以下の式で表される。
電気泳動移動度は、移動時間と電場強度から実験的に決定できます。
ここで、は入口から検出点までの距離、は分析対象物が検出点に到達するのに必要な時間(移動時間)、は印加電圧(電場強度)、はキャピラリーの全長です。[ 4 ]荷電イオンのみが電場の影響を受けるため、中性分析対象物はキャピラリー電気泳動では分離が不十分です。
キャピラリー電気泳動における分析対象物質の移動速度は、緩衝液の電気浸透流(EOF)の速度にも依存します。典型的なシステムでは、電気浸透流は負に帯電した陰極に向かって流れ、緩衝液はキャピラリーを通ってソースバイアルから目的のバイアルへと流れます。異なる電気泳動移動度によって分離された分析対象物質は、反対の電荷を持つ電極に向かって移動します。[ 2 ]その結果、図3に示すように、負に帯電した分析対象物質はEOFと反対方向に正に帯電した陽極に引き寄せられ、正に帯電した分析対象物質はEOFと一致する方向に陰極に引き寄せられます。

電気浸透流の速度は次のように表すことができます。
ここで、電気浸透移動度は次のように定義されます。
ここで、は毛細管壁のゼータ電位、は緩衝液の比誘電率です。実験的には、電気浸透移動度は中性分析物の保持時間を測定することで決定できます。 [ 4 ]電界中における分析物の 速度( )は次のように定義されます。
緩衝液の電気浸透流は一般に分析対象物質の電気泳動移動度よりも大きいため、すべての分析対象物質は緩衝液とともに陰極に向かって運ばれます。緩衝液の比較的強力な電気浸透流によって、小さな三価陰イオンでさえ陰極へと向かわせることができます。負に帯電した分析対象物質は、電気泳動移動度が相反するため、キャピラリー内に長く保持されます。[ 2 ]検出器で観測される移動順序は図3に示されています。小さな多価陽イオンは速く移動し、小さな多価陰イオンは強く保持されます。[ 4 ]
電気浸透流は、内壁に固定電荷を持つキャピラリー内の溶液に電場を印加したときに観察されます。緩衝液をキャピラリー内に入れると、キャピラリーの内面に電荷が蓄積されます。フューズドシリカキャピラリーでは、キャピラリーの内壁に結合したシラノール(Si-OH) 基は、pH 値が 3 を超えると、負に帯電したシラノエート (Si-O − ) 基にイオン化されます。緩衝液を導入する前に、まずNaOHやKOHなどの塩基性溶液をキャピラリーに流すと、キャピラリー壁のイオン化を促進できます。緩衝液の正に帯電した陽イオンは、負に帯電したシラノエート基に引き寄せられ、図 4に示すように、キャピラリー壁に 2 つの内側の陽イオン層 (拡散二重層または電気二重層と呼ばれる) を形成します。最初の層はシラノエート基にしっかりと固定されているため、固定層と呼ばれます。移動層と呼ばれる外層は、シラノエート基から遠い。電界が印加されると、移動陽イオン層は負に帯電した陰極の方向に引っ張られる。これらの陽イオンは溶媒和されているため、緩衝液全体が移動層とともに移動し、緩衝液の電気浸透流を引き起こす。テフロンキャピラリーを含む他のキャピラリーも電気浸透流を示す。これらのキャピラリーのEOFは、緩衝液の電荷イオンがキャピラリー壁に吸着した結果であると考えられる。 [ 2 ] EOFの速度は、電界強度とキャピラリー壁の電荷密度に依存する。壁の電荷密度は緩衝液のpHに比例する。電気浸透流はpHとともに増加し、キャピラリー壁の利用可能なシラノールがすべて完全にイオン化されるまで続く。[ 4 ]

陰極に向かう強い電気浸透流が望ましくない状況では、キャピラリーの内面をポリマー、界面活性剤、または低分子でコーティングすることで電気浸透を非常に低いレベルにまで低減し、通常の移動方向(陰イオンは陽極へ、陽イオンは陰極へ)に戻すことができます。CE機器には通常、極性反転可能な電源が付属しており、同じ機器を「通常」モード(EOFとキャピラリーの陰極端付近での検出)と「逆」モード(EOFを抑制または反転し、キャピラリーの陽極端付近での検出)で使用できます。1985年にStellan Hjerténによって報告されたEOF抑制のための最も一般的な方法の1つは、線状ポリアクリルアミドを共有結合させた層を形成することです。[ 8 ] キャピラリーのシリカ表面は、まず重合性ビニル基を有するシラン試薬(例えば、3-メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン)で修飾され、続いてアクリルアミドモノマーとフリーラジカル開始剤が導入される。アクリルアミドはin situで重合し、長い直鎖を形成する。その一部は壁に結合したシラン試薬に共有結合する。キャピラリー表面を共有結合修飾する方法は他にも数多く存在する。動的コーティングまたは吸着コーティング(ポリマーまたは低分子を含む場合がある)も一般的である。[ 9 ] 例えば、DNAのキャピラリーシーケンシングにおいて、ふるい分けポリマー(典型的にはポリジメチルアクリルアミド)は電気浸透流を非常に低いレベルに抑制する。[ 10 ] 電気浸透流を調節するだけでなく、キャピラリー壁コーティングは、「粘着性のある」分析対象物(タンパク質など)とキャピラリー壁との相互作用を低減する目的にも役立つ。このような壁と分析物の相互作用がひどい場合は、ピーク効率の低下、非対称(テーリング)ピーク、さらには分析物がキャピラリー壁へ完全に失われるといった現象が発生します。
キャピラリー電気泳動における理論段数、つまり分離効率は次のように表されます。
ここで、 は理論段数、は分離媒体中の見かけの移動度、は分析対象の拡散係数です。 この式によれば、分離効率は拡散によってのみ制限され、電場の強度に比例しますが、実用上の考慮から電場の強度は 1 センチメートルあたり数百ボルトに制限されます。 非常に高い電位 (>20-30 kV) を印加すると、キャピラリーのアーク放電または絶縁破壊につながる可能性があります。 さらに、強い電場を印加すると、キャピラリー内のバッファーの抵抗加熱 (ジュール加熱) につながります。 電場の強度が十分に高い場合、この加熱はキャピラリー内に放射状の温度勾配が生じるほど強力です。 イオンの電気泳動移動度は一般に温度に依存するため (温度依存のイオン化と溶媒粘性効果の両方による)、不均一な温度プロファイルはキャピラリー全体の電気泳動移動度の変動と分解能の低下につながります。顕著なジュール熱の発生は、「オームの法則プロット」を作成することで判定できます。このプロットでは、キャピラリーを流れる電流を印加電位の関数として測定します。低電界では電流は印加電位に比例します(オームの法則)。一方、高電界では、加熱によって緩衝液の抵抗が減少するため、電流は直線から外れます。最良の分解能は通常、ジュール熱が無視できる最大電界強度(すなわち、オームの法則プロットの線形領域と非線形領域の境界付近)で得られます。一般的に、内径の小さいキャピラリーは、大きなキャピラリーに比べて放熱性が高く、温度勾配が小さいため、より高い電界強度で使用できますが、光路長が短いため吸光度検出の感度が低く、緩衝液とサンプルをキャピラリーに導入するのが困難(小さいキャピラリーでは、流体をキャピラリーに流すのに高い圧力と/またはより長い時間が必要)という欠点があります。
キャピラリー電気泳動分離の効率は、通常、HPLCなどの他の分離技術の効率よりもはるかに高い。HPLCとは異なり、キャピラリー電気泳動では相間の物質移動は起こらない。 [ 4 ] さらに、EOF駆動システムのフロープロファイルは、図5に示すようにクロマトグラフィーカラムの圧力駆動流に特徴的な丸みを帯びた層流プロファイルではなく、平坦である。その結果、EOFは圧力駆動クロマトグラフィーのようにバンドの広がりに大きく寄与しない。キャピラリー電気泳動分離は、数十万の理論段数を持つことができる。[ 11 ]

キャピラリー電気泳動分離の分解能()は次のように表すことができます。
この式によれば、電気泳動移動度と電気浸透移動度の大きさが同程度で、かつ符号が逆のときに最大分解能が得られる。さらに、高分解能を得るには速度を低くする必要があり、それに応じて分析時間も長くなることがわかる。[ 4 ]
拡散とジュール熱(上記で説明)の他に、キャピラリー電気泳動の分解能を上記式の理論限界から低下させる要因としては、注入プラグと検出ウィンドウの有限な幅、分析物とキャピラリー壁の相互作用、サイフォン現象につながる流体リザーバーの高さのわずかな違いなどの機器の非理想性、キャピラリー端の切断が不完全な場合などによる電場の不規則性、リザーバーの緩衝能力の枯渇、電気分散(分析物の導電率がバックグラウンド電解質よりも高い場合)などがありますが、これらに限定されるわけではありません。[ 12 ] バンドの広がりのさまざまな原因を特定して最小限に抑えることが、拡散限界分解能の理想に可能な限り近づくことを目的としたキャピラリー電気泳動法の成功の鍵となります。
キャピラリー電気泳動は唾液中のNH4 +、 Na +、K +、Mg2 +、Ca2 +イオンの同時測定に使用できます。[ 13 ]
法医学におけるCEの主な応用の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いたDNA断片の増幅・検出法の開発であり、これにより法医学的DNA分析は急速かつ劇的な進歩を遂げました。DNA分離は、ふるい分け緩衝液を満たした細いCE 50mmフューズドシリカキャピラリーを用いて行われます。これらのキャピラリーは優れた放熱性を有しており、スラブゲル電気泳動よりもはるかに高い電界強度を使用することができます。そのため、キャピラリー内での分離は迅速かつ効率的です。さらに、キャピラリーは容易に補充・交換できるため、効率的かつ自動化された注入が可能です。検出は、キャピラリーにエッチングされた窓を通して蛍光を発することで行われます。シングルキャピラリー装置とキャピラリーアレイ装置はどちらも、16個以上のサンプルを同時に処理できるアレイシステムを備えており、スループットが向上しています。[ 14 ]
法医学生物学者によるCEの主な用途は、生物学的サンプルからSTRをタイピングし、個人間で異なる高度に多型的な遺伝子マーカーからプロファイルを作成することです。CEの他の新たな用途としては、法医学サンプルの生物学的体液または組織の起源を特定するために、特定のmRNA断片を検出することが挙げられます。[ 15 ]
法医学におけるCEのもう一つの応用はインク分析です。インクジェットプリンターで印刷された文書の偽造がますます頻発しているため、インクジェット印刷インクの分析はますます重要になっています。インクの化学組成は、偽造文書や偽造紙幣のケースにおいて非常に重要な情報を提供します。ミセル電気泳動キャピラリークロマトグラフィー(MECC)が開発され、紙から抽出されたインクの分析に適用されています。化学的に類似した複数の物質を含むインクと比較して高い分解能を有するため、同一メーカーのインク間の差異も区別できます。そのため、インクの化学組成に基づいて文書の出所を評価するのに適しています。同じカートリッジが異なるプリンターモデルと互換性を持つ可能性があるため、MECC電気泳動プロファイルに基づくインクの識別は、プリンターモデルではなく、インクカートリッジ(製造元とカートリッジ番号)を特定する上でより信頼性の高い方法であることは注目に値します。[ 16 ]
特殊なタイプのCEであるアフィニティキャピラリー電気泳動(ACE)は、分子間結合相互作用を利用してタンパク質-リガンド相互作用を理解します。[ 17 ]製薬会社はさまざまな理由でACEを使用しますが、主な理由の1つは、薬物とリガンド、または薬物とミセルなどの特定の媒体システムの会合/結合定数です。これは、そのシンプルさ、迅速な結果、および分析物の使用量が少ないため、広く使用されている手法です。[ 18 ] ACEの使用により、分析物の結合、分離、および検出に関する具体的な詳細が得られ、生命科学の研究に非常に実用的であることが証明されています。 アプタマーベースのアフィニティキャピラリー電気泳動は、特定のアフィニティ試薬の分析と修飾に使用されます。修飾されたアプタマーは理想的には高い結合親和性、特異性、およびヌクレアーゼ耐性を示します。[ 19 ] Ren et al.アプタマーに修飾ヌクレオチドを組み込むことで、IL-1αとアプタマー間の疎水性および極性相互作用から新たな対立特性と高親和性相互作用が導入された。[ 20 ] HuangらはACEを用いてアプタマーを用いたタンパク質間相互作用を研究した。α-トロンビン結合アプタマーは選択的蛍光プローブとして使用するために6-カルボキシフルオレセインで標識され、タンパク質間およびタンパク質-DNA相互作用の結合部位に関する情報を明らかにするために研究された。[ 21 ]
キャピラリー電気泳動(CE)は、 DNAシーケンシングを行うための重要かつ費用対効果の高い手法となり、高スループットで高精度なシーケンシング情報を提供します。WoolleyとMathysはCEチップを用いて、DNA断片を97%の精度でシーケンシングし、540秒で150塩基のシーケンシングを達成しました。[ 22 ]彼らは4色標識および検出フォーマットを用いて蛍光データを収集しました。蛍光は、核酸配列の各部分(A、T、C、G)の濃度を観察するために使用され、検出からグラフ化されたこれらの濃度ピークは、DNAの配列を決定するために使用されます。[ 22 ]