超解像顕微鏡
光学顕微鏡における一連の技術

超解像顕微鏡法は、光の回折による回折限界[ 1 ] [2]によって課される解像度よりも高い解像度を画像に持たせることができる光学顕微鏡法の一連の技術である。 [3]超解像画像化技術は、近接場（光子トンネル顕微鏡法[4]やペンドリースーパーレンズや近接場走査型光学顕微鏡を使用するもの）または遠場に依存している。後者に依存する技術の中には、閉じたピンホールを使用する共焦点顕微鏡法や、デコンボリューション [5] などの計算方法や検出器ベースのピクセル再割り当て（再走査顕微鏡法[6 ]ピクセル再割り当て[7]など）を利用したもの、 4Pi顕微鏡、SIM [8] [9]やSMIなどの構造化照明顕微鏡技術など、回折限界を超えても解像度がわずかに（最大約2倍）しか向上しないものがある。

遠距離場における超解像顕微鏡法には、解像度を大幅に向上させることができる2つの主要な方法があります。[10]

  1. 決定論的超解像：生物顕微鏡で最も一般的に用いられる蛍光色素分子は、励起に対して非線形応答を示すため、これを利用して解像度を向上させることができます。このような手法としては、STED、GSD、RESOLFT、SSIMなどがあります。
  2. 確率的超解像：多くの分子光源は化学的に複雑であるため、複雑な時間的挙動を示す。これを利用して、複数の近接する蛍光色素分子を別々の時間に発光させることで、時間的に分離することが可能になる。これらの手法には、超解像光揺らぎイメージング（SOFI）や、 SPDM、SPDMphymod、PALM、FPALM、STORM、dSTORMといったあらゆる単一分子局在化法（SMLM）が含まれる。

2014年10月8日、ノーベル化学賞は「光学顕微鏡をナノ次元にまで到達させる」超解像蛍光顕微鏡の開発により、エリック・ベツィグ、WE・モーナー、シュテファン・ヘルの3氏に授与されました。[11] [12]超解像顕微鏡の様々な手法は、生物医学研究コミュニティでますます採用されており、これらの技術は分子レベルでの生物学的機能の理解に不可欠なツールになりつつあります。[13]

歴史

1978年までに、アッベ限界を破るための最初の理論的アイデアが開発されました。これは、 4Pi顕微鏡を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡として使用することを要求し、光をすべての側面から共通の焦点に集束させ、その焦点を使用して「点ごと」の励起と「点ごと」の検出を組み合わせて物体をスキャンすることを要求しました。[14] しかし、1978年の出版物[15] は、不適切な物理的結論（つまり、点状の光スポット）を導き出し、立体角の反対側を追加することによる実際の利点である軸方向解像度の向上を完全に見落としていました。[16]

以下の情報の一部は、化学ブログのサブ回折顕微鏡技術のレビューから（許可を得て）収集したものです。[17] [18]

1986年、オコニンは誘導放出に基づく超解像光学顕微鏡の特許を取得しました。[19]

超解像技術

光子トンネル顕微鏡（PTM）

光子トンネル顕微鏡（PTM）は、近接場走査型光学顕微鏡（NSOM）の一種であり、光子トンネル現象を利用して回折限界を超える。PTMでは、試料表面に極めて近接した、典型的には数ナノメートル以内に配置された鋭い光ファイバーの先端を用いる。光が光ファイバーの先端を通過すると、エバネッセント波が隙間を通り抜けて試料と相互作用し、波長以下の分解能での画像化が可能となる。[20]

PTMは、試料表面のエバネッセント場に対する感度が高いため、高い空間分解能が得られます。分解能は、光の波長ではなく、主に探針の形状と試料からの距離によって決まります。この技術は生物試料や固体試料に適用されており、ナノスケールにおける表面形態や光学特性に関する知見を提供しています。

局所増強 / ANSOM / 光ナノアンテナ

無開口近接場走査光学顕微鏡（ANSOM）は、散乱型走査近接場光学顕微鏡（s-SNOM）とも呼ばれ、多くの場合金属製の鋭い先端近傍の光場を局所的に増強することで超解像イメージングを実現します。ANSOMでは、金属または誘電体プローブが入射光と相互作用し、局所表面プラズモン共鳴によって先端の先端に閉じ込められた増強された電磁場を生成します。

光ナノアンテナは、光をナノスケールの体積に集中させる共振器として機能し、局所的な電場強度と感度を高めることで、分解能をさらに向上させることができます。これらのナノアンテナは特定の光周波数で共振するように設計されており、照明モードと検出モードの両方で使用され、回折限界をはるかに下回る空間分解能を実現します。

近接場光ランダムマッピング（NORM）顕微鏡

近接場光ランダムマッピング（NORM）顕微鏡法は、液浸液中のナノ粒子のブラウン運動を観察することにより、遠距離場顕微鏡で光近接場を取得する方法である。[21] [22]

NORM法は、確率的に移動するナノ粒子を用いて物体表面を走査する手法です。顕微鏡を通して見ると、ナノ粒子は対称的な円形の点のように見えます。この点の幅は点像分布関数（約250 nm）に相当し、顕微鏡の解像度によって定義されます。与えられた粒子の横方向座標は、顕微鏡の解像度よりもはるかに高い精度で評価できます。多数のフレームから情報を収集することで、顕微鏡の視野全体にわたる近接場強度分布をマッピングすることができます。NSOM法やANSOM法と比較して、この手法はチップの位置決めに特別な装置を必要とせず、広い視野と深い焦点深度を備えています。多数の走査「センサー」を使用することで、より短時間で画像を取得できます。

4Pi

4Pi顕微鏡は、軸方向分解能が向上したレーザー走査型蛍光顕微鏡です。通常500～700 nmの分解能を100～150 nmまで向上させることができ、これは標準的な共焦点顕微鏡の5～7分の1の体積でほぼ球形の焦点に相当します。

解像度の向上は、2つの対向する対物レンズを用いることで達成されます。これらのレンズは、どちらも同じ幾何学的位置に焦点を合わせます。また、 2つの対物レンズの光路長差は、慎重に最小限に抑えられています。これにより、両対物レンズの共通焦点領域に存在する分子は、両側からコヒーレントに照射され、反射光または発光光はコヒーレントに集光されます。つまり、検出器上で発光光をコヒーレントに重ね合わせることが可能です。照明と検出に用いられる立体角は 拡大され、サンプルが全方向から同時に照射・検出される理想的な状態に近づきます。[23] [24] Ω {\displaystyle \Omega }

これまで、4Pi顕微鏡の最高品質は、固定細胞でのSTED顕微鏡法[25]と生細胞でのスイッチングタンパク質を用いたRESOLFT顕微鏡法との組み合わせで達成されてきました。[26]

構造化照明顕微鏡（SIM）

共焦点レーザー走査顕微鏡（上）と3D構造化照明顕微鏡（3D-SIM顕微鏡、下）の解像度の比較。核膜の詳細が示されている。核孔（抗NPC）は赤、核膜（抗ラミン）は緑、クロマチン（DAPI染色）は青。スケールバー：1 μm。

「構造化照明顕微鏡法」（SIM）という用語は2000年代初頭に広く使われるようになりましたが、ジョン・M・ゲラは1990年代にすでにエバネッセント波干渉による超解像効果を実証しており、その基本原理の多くを独自に予測していました。[27]

構造化照明顕微鏡法（SIM）は、観測可能領域外の周波数空間から情報を収集することで空間分解能を向上させます。このプロセスは逆格子空間で行われます。SI画像のフーリエ変換（FT）には、逆格子空間の異なる領域からの追加情報が重ねて含まれています。照明を位相シフトさせた複数のフレームを用いることで、より多くの解像度情報を持つFT画像を計算的に分離・再構成することが可能になります。逆FTは、再構成された画像を超解像画像に戻します。

SIMは、一部の医療診断ツールとして電子顕微鏡に取って代わる可能性があります。これには、腎疾患[28] 、腎臓がん[29] 、血液疾患[30]の診断が含まれます。

「構造化照明顕微鏡法」という用語は後世に他者によって造語されたが、ゲラ（1995）は、50nmピッチの格子によってパターン化された光を、50nmピッチの2番目の格子に照射し、格子を倍率を達成するために必要な角度だけ互いに回転させるという結果を初めて発表した[31 ]。照射波長は650nmであったが、50nmの格子は容易に解像できた。これは、使用した開口数と波長で得られるはずの最小値であるアッベ分解能限界232nmの約5倍の改善を示した。この研究をさらに発展させ、ゲラはエバネッセント場の位相シフトによって超解像横方向トポグラフィーが達成されることを示した。ゲラは個人または同僚と共同で複数の米国特許[32]を取得し、ポラロイド社に譲渡された。この技術のライセンスは、光学データストレージおよび顕微鏡検査におけるこの超解像度技術の使用のために、Dyer Energy Systems、Calimetrics Inc.、および Nanoptek Corp. によって取得されました。

  • 3D-SIM で記録された細胞核と有糸分裂段階の画像。
  • 比較共焦点顕微鏡 – 3D-SIM
    比較共焦点顕微鏡 – 3D-SIM
  • さまざまな角度から見た前期細胞核
    さまざまな角度から見た前期細胞核
  • 前期にあるマウスの細胞核 2 つ。
    前期にあるマウスの細胞核 2 つ。
  • 終期のマウス細胞
    終期のマウス細胞

空間変調照明（SMI）

黄斑変性症の影響を受けたヒト眼組織のSMI + TIRF

構造化照明の実装例の一つに、空間変調照明（SMI）があります。標準的な構造化照明と同様に、SMI技術は顕微鏡の点像分布関数（PSF）を適切に修正します。しかし、この場合、「光学分解能自体は向上しません」[33] 。構造化照明は、蛍光体の距離測定の精度を最大限に高め、「数十ナノメートルの分子サイズでのサイズ測定を可能にする」ために使用されます。[33]

Vertico SMI顕微鏡は、軸に沿って1本または2本の対向する干渉レーザービームを用いることで構造化照明を実現します。撮像対象物は波動場内を高精度にステップ移動されるか、あるいは波動場自体が位相シフトによって対象物に対して相対的に移動されます。これにより、軸方向のサイズと距離分解能が向上します。[33] [34] [35]

SMIは、他の超解像技術、例えば、横方向構造化照明を備えた全反射干渉計として3D LIMONまたはLSI- TIRFと組み合わせることができます（この最後の機器と技術は、本質的に位相シフト光子トンネル顕微鏡であり、位相シフトエバネッセント場を備えた全反射光顕微鏡を採用しています（Guerra、1996）。[32]このSMI技術により、これまでにない光学解像度で、人間の眼組織の切片における自己蛍光体の分布の光光学画像を取得することができます。3つの異なる励起波長（488、568、および647 nm）を使用すると、自己蛍光信号に関するスペクトル情報を収集できます。これは、黄斑変性症に罹患した人間の眼組織を調べるために使用されています。[36]

バイオセンシング

バイオセンシングは、細胞生物学において細胞成分の活動を理解する上で極めて重要です。遺伝子組み換えセンサーはこの分野に革命をもたらし、典型的には2つの部分、すなわち細胞活動や相互作用を検出するセンシングドメインと、測定可能なシグナルを生成するレポーティングドメインから構成されています。センサーには主に2つの種類があります。1つは2つの蛍光色素を用いて正確な定量を可能にするFRETベースのセンサーですが、いくつかの限界があります。もう1つは、より小型で高速で、多重実験を可能にする単一蛍光色素バイオセンサーです。ただし、絶対値の取得や応答飽和の検出に課題があります。超解像光揺らぎイメージングを含む様々な顕微鏡法が、生物学的活動をリアルタイムで定量・モニタリングするために用いられてきました。例としては、カルシウム、pH、電圧のセンシングなどが挙げられます。Greenwaldらは、これらの応用についてより包括的な概要を提供しています。[37]

決定論的機能技術

RESOLFT（可逆飽和光学蛍光遷移）顕微鏡法は、従来の顕微鏡法や共焦点顕微鏡法では観察できない試料の細部を観察できる非常に高い解像度を持つ光学顕微鏡法です。RESOLFTは、STED顕微鏡法[38] [39]とGSD顕微鏡法の原理を一般化しています。また、RESOLFTやSSIMとは異なる概念を持つ技術もあります。例えば、窒素空孔中心の光学的ANDゲート特性を利用した蛍光顕微鏡法[40]や、黒体放射の固有の超線形性を利用し、超解像の概念を顕微鏡法の域を超えて拡張した熱放射誘導放出（SETR）による超解像法[41]などがあります。

誘導放出抑制（STED）

従来の共焦点顕微鏡と STED 顕微鏡間の解像度の向上。

誘導放出抑制顕微鏡法（STED顕微鏡法）では、2つのレーザーパルス、すなわち蛍光体を蛍光状態に励起するための励起パルスと、誘導放出によって蛍光体を脱励起するためのSTEDパルスを使用する。[19] [42] [ 43] [44] [45] [46]実際には、励起レーザーパルスが最初に適用され、その後すぐにSTEDパルスが続く（連続波レーザーを使用したパルスなしのSTEDも使用される）。さらに、STEDパルスは、励起焦点と一致するゼロ強度スポットを特徴とするように修正される。誘導放出率はSTEDビームの強度に非線形に依存するため、焦点励起スポットの周りのすべての蛍光体はオフ状態（蛍光体の基底状態）になる。この焦点をスキャンすることで、画像を取得する。励起焦点の点広がり関数（PSF）の半値全幅（ FWHM）は、理論的には式（ 1）に従ってSTEDパルスの強度を上げることによって任意の幅に圧縮することができる。

Δ r ≈ Δ 1 + I max / I s {\displaystyle \Delta r\approx {\frac {\Delta }{\sqrt {1+I_{\max }/I_{s}}}}}    （1）
ここで、∆r は横方向解像度、∆ は回折限界 PSF の FWHM、I maxは STED レーザーのピーク強度、飽和発光減衰を達成するために必要な閾値強度です。 I s {\displaystyle I_{s}}

STEDの主な欠点は、装置が複雑であることであり、これが広く普及することを妨げている。一方で、広い視野では、画像を取得するためにサンプルをスキャンする必要があるため、画像取得速度は比較的遅い。一方、狭い視野では非常に高速であり、最大80フレーム/秒の記録が報告されている。[47] [48] STEDはIs値が大きいため、高強度の励起パルスが必要となり、サンプルに損傷を与える可能性がある。

基底状態枯渇（GSD）

基底状態消光顕微鏡法（GSD顕微鏡法）では、蛍光体の三重項状態をオフ状態、一重項状態をオン状態として用いる。励起レーザーを用いて一重項状態分子の周縁にある蛍光体を三重項状態に励起する。これはSTEDとよく似ており、STEDでは蛍光体の基底状態がオフ状態であるため、式（1）がこの場合にも適用される。この値はSTEDよりも小さいため、はるかに低いレーザー強度で超解像イメージングが可能となる。しかし、STEDと比較すると、GSDで使用される蛍光体は一般的に光安定性が低く、三重項状態の飽和を実現するのが難しい場合がある。[49] I s {\displaystyle I_{s}}

飽和構造化照明顕微鏡（SSIM）

飽和構造化照明顕微鏡法（SSIM）は、蛍光体の発光率が励起レーザーの強度に非線形に依存することを利用する。[50]蛍光体を蛍光状態に飽和させるのに必要なピーク強度に近い正弦波照明パターン[51]を適用することで、モアレ縞が得られる。この縞には高次の空間情報が含まれており、計算技術によって抽出することができる。この情報が抽出されると、超解像画像が得られる。

SSIMでは、照明パターンを複数回シフトさせる必要があるため、この技術の時間分解能が実質的に制限されます。さらに、飽和状態にあるため、非常に光安定性の高い蛍光色素が必要であり、これが試料に放射線損傷を与え、SSIMの適用範囲を制限します。

この顕微鏡の例は、「構造化照明顕微鏡 (SIM)：3D-SIM 顕微鏡で記録された細胞核と有糸分裂段階の画像」セクションに示されています。

確率関数法

局在顕微鏡検査

単分子局在顕微鏡法（SMLM）は、エミッターを分離し、その画像を点像分布関数（PSF）でフィッティングすることで超解像を達成するすべての顕微鏡技術を総括したものです。通常、点像分布関数の幅（約250 nm）が解像度を制限します。しかし、孤立したエミッターが与えられた場合、式（2）に従って、その強度によってのみ制限される精度でその位置を特定することができます。[52]

Δ l o c ≈ Δ N {\displaystyle \Delta \mathrm {loc} \approx {\frac {\Delta }{\sqrt {N}}}}    （2）
ここで、Δloc は局在精度、Δ は PSF の FWHM (半値全幅)、N は収集された光子の数です。

このフィッティングプロセスは、孤立したエミッターに対してのみ確実に実行できます（デコンボリューション参照）。また、興味深い生物学的サンプルはエミッターで非常に密に標識されているため、すべてのエミッターが同時に活性化されるとフィッティングは不可能になります。SMLM技術は、エミッターのまばらなサブセットのみを同時に活性化し、これらの少数のエミッターを非常に正確に特定した後、それらを非活性化し、別のサブセットを活性化することで、このジレンマを解決します。

背景とカメラのピクセル化を考慮し、典型的な顕微鏡の点広がり関数（エアリーディスク）のガウス近似を使用して、理論的な解像度はThompsonらによって提案され、Mortensenらによって微調整されました。[54 ]

σ 2 = σ P S F 2 + a 2 / 12 N s i g ( 16 9 + 8 π N b g ( σ P S F 2 + a 2 / 12 ) N s i g a 2 ) {\displaystyle \sigma ^{2}={\frac {\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12}{N_{sig}}}\left({\frac {16}{9}}+{\frac {8\pi N_{bg}(\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12)}{N_{sig}a^{2}}}\right)}
どこ
* σは、同じ分子を複数回測定した場合（例：ビデオのフレーム）の中心位置のガウス標準偏差です。（単位：m）
* σ PSFは点広がり関数のガウス標準偏差であり、そのFWHMはエルンスト・アッベの式d = λ/(2 NA)に従います。(単位 m)
* aは画像の各ピクセルのサイズです。（単位はm）
* N sig は、対象となるすべてのピクセルの合計PSFの光子数です。（単位なし）
* N bg は、ピクセルあたりの平均背景光子カウント（ダークカウントは既に除去済み）であり、これは、各ピクセルのポアソン分布背景ノイズのガウス標準偏差の2乗、または背景ノイズのみを含む全ピクセルの標準偏差σ bg 2として近似されます。σ bg 2が大きいほど、近似値は向上します（例えば、 σ bg 2 >10の場合は良好、σ bg 2 >1000の場合は非常に良好です）。（単位なし）
* 解像度FWHMはガウス標準偏差の約 2.355 倍です。

一般的に、局在顕微鏡法は蛍光体を用いて行われる。適切な蛍光体（例えばSTORM用）は、ほとんどの時間、非蛍光の暗状態にあり、通常は低強度の励起レーザーによって確率的に活性化される。読み出しレーザーは蛍光を刺激し、蛍光体を退色または光スイッチさせて暗状態に戻す。これは通常10～100ミリ秒以内である。PAINT（Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography）法では、蛍光体は結合前は非蛍光性であり、結合後に蛍光を発する。蛍光相中に放出された光子はカメラで収集され、結果として得られる蛍光体画像（PSFによって歪んでいる）は、数オングストローム程度という非常に高い精度でフィッティングすることができる。[55]このプロセスを数千回繰り返すことで、すべての蛍光体が明状態を経て記録されることが保証される。その後、コンピューターが超解像画像を再構成する。

これらの方法で使用される蛍光色素分子は、解像度を最大限に高めるために、明るいことが求められます。つまり、高い吸光係数と高い量子収率を持つ必要があります。また、高いコントラスト比（明状態で放出される光子数と暗状態で放出される光子数の比）も必要です。さらに、ナイキスト基準によれば、高密度に標識されたサンプルが望ましいです。

多数の局在顕微鏡検査法は、主に使用される蛍光体の種類が異なります。

STORM、PALM、FPALM

確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）、光活性化局在顕微鏡法（PALM）、蛍光光活性化局在顕微鏡法（FPALM）は、光スイッチング可能な蛍光色素分子の連続的な活性化と時間分解局在を利用して高解像度画像を作成する超解像イメージング技術です。イメージング中は、光学的に分解可能な蛍光色素分子のサブセットのみが特定の瞬間に蛍光状態に活性化されるため、特定の蛍光色素分子の単分子画像の重心位置を求めることで、各蛍光色素分子の位置を高精度に特定できます。その後、蛍光色素分子のサブセットを1つ不活性化し、別のサブセットを活性化してイメージングします。このプロセスを繰り返すことで、多数の蛍光色素分子を局在化し、画像データから超解像画像を構築することができます。

これら3つの方法は短期間のうちに独立して発表されましたが、原理は同一です。STORMは当初、核酸またはタンパク質に結合したCy5およびCy3色素を用いて記述されました[56]。一方、PALMおよびFPALMは光スイッチング可能な蛍光タンパク質を用いて記述されました[57] [58] 。原理的には、あらゆる光スイッチング可能な蛍光体を使用でき、STORMは様々なプローブおよび標識戦略を用いて実証されています。Cy5などの単一蛍光体の確率的光スイッチングを用いることで[59]、STORMは単一の赤色レーザー励起光源で実行できます。赤色レーザーは、付加体の形成によってCy5蛍光体を暗状態に切り替え[60] [61]、その後分子を蛍光状態に戻します。STORMでは、他にも多くの色素が使用されています[62] [63] [64] [65] [66] [67]。

In addition to single fluorophores, dye-pairs consisting of an activator fluorophore (such as Alexa 405, Cy2, or Cy3) and a photoswitchable reporter dye (such as Cy5, Alexa 647, Cy5.5, or Cy7) can be used with STORM. [56] [68] [69] In this scheme, the activator fluorophore, when excited near its absorption maximum, serves to reactivate the photoswitchable dye to the fluorescent state. Multicolor imaging has been performed by using different activation wavelengths to distinguish dye-pairs, depending on the activator fluorophore used, [68] [69] [70] or using spectrally distinct photoswitchable fluorophores, either with or without activator fluorophores. [62] [71] [72] Photoswitchable fluorescent proteins can be used as well. [57] [58] [72] [73]光スイッチプローブを用いた生物学的構造の高度に特異的な標識は、抗体染色、 [68] [69] [70] [74]タンパク質の直接結合、[75]および遺伝子エンコードによって達成されている。[57] [58] [72] [73]

STORMは光学的非点収差を用いた3次元イメージングにも拡張されており、楕円形の点像分布関数を用いて厚さ数マイクロメートルまでのサンプルのx、y、z位置を符号化することができる[69] [74]。また、生細胞においてもその効果が実証されている[72] 。現在までに、この技術によって達成された空間分解能は横方向で約20nm、軸方向で約50nmであり、時間分解能は0.1～0.33秒と高速である。[要出典]

スペクトル精密距離顕微鏡（SPDM）

単一YFP分子超解像顕微鏡 / SPDMphymod

単一の小さな光源は、通常の顕微鏡の解像度よりもはるかに正確に位置を特定できます。光によってぼやけたスポットが生成されますが、顕微鏡の点像分布関数、検出器のノイズ特性などを考慮したコンピュータ アルゴリズムを使用して、ぼやけたスポットの中心を正確に計算できます。ただし、この方法は、互いに非常に近い光源が多数ある場合は機能しません。その場合、光源はすべて一緒にぼやけてしまいます。

スペクトル精密距離顕微鏡法（SPDM）は、蛍光顕微鏡における位置特定技術の一種であり、一度に少数の光源のみを測定することで、多数の光源が存在するという問題を回避します。これにより、各光源は他の光源から「光学的に分離」されます（つまり、顕微鏡の分解能（通常約200～250 nm）よりも離れた位置になります）。[76] [77] [78]この「光学的分離」には、検査対象の粒子が異なるスペクトル特性を持つ必要があるため、適切な光源とフィルターを用いることで、一度に少数の分子からの光を観察することが可能になります。これにより、有効点像関数の主極大値の半値幅で表される従来の光学分解能よりも数倍優れた有効光学分解能が得られます。[76]

SPDMを用いて達成可能な構造分解能は、異なるスペクトル特性を持つ2つの点状粒子間の測定可能な最小距離（「位相分解能」）で表すことができます。モデル化により、局在精度、粒子密度などに関する適切な条件下では、「位相分解能」は「空間周波数」に対応し、これは古典的な定義によれば、はるかに向上した光学分解能に相当することが示されています。また、蛍光寿命などの技術に基づいて、分子をさらに微妙に識別することも可能です。[76]

重要な応用分野の一つはゲノム研究（ゲノムの機能的構成の研究）です。もう一つの重要な利用分野は膜構造の研究です。

SPDMフィモッド
GFPとRFP融合タンパク質を用いたデュアルカラー局在顕微鏡法SPDMphymod/超解像顕微鏡法

GFP、Alexa Fluor色素、フルオレセイン分子といった多くの標準的な蛍光色素を用いた局在顕微鏡観察は、特定の光物理的条件が存在すれば可能である。このいわゆる物理的に修飾可能な蛍光体（SPDMphymod）技術では、適切な強度の単一レーザー波長でナノイメージングが可能であり[79]、特殊な光スイッチング/光活性化蛍光分子を用いる他の局在顕微鏡観察技術では2つのレーザー波長が必要となるのとは対照的である。SPDMphymodのさらなる応用例としては、タバコモザイクウイルス（TMV）粒子の分析[80]やウイルスと細胞の相互作用の研究が挙げられる[81] [82]。

SPDMphymodでは、一重項-三重項状態遷移に基づき、このプロセスが継続的であること、そして単一分子がまず非常に長寿命の可逆的な暗状態（半減期は最大数秒）に移行し、そこから数ミリ秒間多くの光子を放出する蛍光状態に戻り、その後再び非常に長寿命の、いわゆる不可逆な暗状態に戻ることが極めて重要である。SPDMphymod顕微鏡では、同じスペクトル光周波数を放出するが、その発光特性に基づいて異なるスペクトルシグネチャを持つ蛍光分子を使用する。同一細胞の2000枚の画像を組み合わせることで、レーザー光学精密測定を用いて、光学解像度が大幅に向上した位置特定画像を記録することができる。[83]

SPDMphymodテクノロジーですでに効果的に使用されている標準的な蛍光染料は、 GFP、RFP、YFP、Alexa 488、 Alexa 568 、 Alexa 647 、Cy2、 Cy3 、 Atto 488 およびフルオレセインです。

3Dにおける極低温光学的局在（COLD）

3 次元極低温光学局在法 (COLD) により、タンパク質ストレプトアビジン内の 4 つのビオチン結合部位を特定できます。

極低温光3次元局在法（COLD）は、単一の小型から中型の生体分子内の複数の蛍光部位をオングストロームスケールの分解能で局在化できる手法である。[55]この手法では、低温での光化学反応が遅いため、光退色前に各蛍光体から放出される光子数が多くなり、局在化精度が向上する。[84] [85]その結果、極低温確率局在顕微鏡法は、小さなタンパク質に結合した複数の蛍光体の3次元位置を解明するために必要な分子レベル以下の分解能を達成する。電子顕微鏡法で知られるアルゴリズムを用いることで、蛍光体の2次元投影像が3次元構造に再構成される。COLDは、標識のサイズに応じて、蛍光顕微鏡法をその根本的な限界まで引き上げる。この手法は、X線結晶構造解析、磁気共鳴分光法、電子顕微鏡法などの他の構造生物学技術と組み合わせることで、貴重な補完情報と特異性を提供することもできる。

結合活性化局在顕微鏡法（BALM）

fBALM DNA構造変動支援結合活性化局在顕微鏡法を用いた超解像単一分子局在顕微鏡法

結合活性化局在顕微鏡法 (BALM) は、単一分子局在顕微鏡法 (SMLM) の一般概念である。SMLM は、DNA と色素の特性の修正に基づいて DNA 結合色素の超解像イメージングを行う。[86]化学環境を注意深く調整することにより、局所的かつ可逆的な DNA 融解と蛍光信号のハイブリダイゼーション制御が可能になり、DNA 結合色素分子を導入することができる。インターカレーティング DNA 色素とマイナーグルーブ結合 DNA 色素を使用すると、一度に少数の DNA 結合色素信号のみを登録し、光学的に分離することができる。DNA 構造変動支援 BALM (fBALM) は、核構造のナノスケールの違いを観察するために使用されており、約 50 nm の構造解像度が期待されている。DNA 構造変動に基づく結合活性化局在顕微鏡法によるクロマチンナノ構造のイメージング。[87]最近、NIAD-4がアミロイドに結合すると蛍光量子収率が著しく増加するという現象が、アミロイド線維[88]とオリゴマー[89]のBALMイメージングに利用されました。

ナノスケールトポグラフィーにおける点群画像化のための点群集積（PAINT）

ナノスケールトポグラフィーにおける点集積イメージング（PAINT）は、分子の吸着/吸収と光退色/脱着によって確率的な単一分子蛍光を実現する単一分子局在法である。[90] [91]最初に使用された染料はナイルレッドであり、これは水溶液中では無蛍光であるが、ミセルや生細胞壁などの疎水性環境に挿入されると蛍光を発する。したがって、染料の濃度はナノモルレベルの低い状態に保たれ、回折限界領域への分子の吸着速度はミリ秒領域である。固定化されたターゲットへの単一染料分子（プローブ）の確率的な結合は、一般的な広視野蛍光顕微鏡下で空間的および時間的に分解することができる。各染料は光退色して視野を暗状態に戻し、次の染料が結合して観察できるようにする。この方法は、他の確率的方法と比較して、固定された標的の超解像画像を取得することに加えて、溶液中の拡散プローブ分子の標的への動的結合速度を測定できることが利点である。[92] [91]

3D超解像技術（例えば、Moernerらのグループが開発した二重らせん点広がり関数）、光活性化色素、電力依存のアクティブ間欠性、およびナノスケール地形像における点の蓄積を組み合わせることで、SPRAIPAINT（SPRAI = Super resolution by PoweR-dependent Active Intermittency [93]）は生細胞壁を超解像することができる。[94] PAINTは色素の吸着/吸収と光退色/脱着速度のバランスを維持することによって機能する。このバランスは統計原理を用いて推定することができる。[95]ガスまたは液体溶液中の表面または界面への希薄溶質の吸着または吸収速度は、フィックの拡散の法則を用いて計算することができる。与えられた溶液条件および照明電力密度に対して光退色/脱着速度を測定できる。

DNA-PAINTはさらに拡張されて通常の染料も使用できるようになりました。この方法では、染料で標識されたDNAプローブが固定されたDNAオリガミに動的に結合および解離することを利用して、確率的な単分子イメージングを実現します。[96] [97] DNA-PAINTはもはや環境感受性染料に限定されず、プローブのターゲットへの吸着および脱離の速度論を測定できます。この方法は、移動する染料のカメラのぼやけ効果を使用します。通常の染料が溶液中で拡散している場合、その速度が比較的速く、カメラの露出時間が比較的長いため、典型的なCCDカメラ上の染料の画像はぼやけ、蛍光バックグラウンドの一因となります。しかし、固定されたターゲットに結合すると染料は動きを停止し、点広がり関数への明確な入力を実現できます。

この手法はmbPAINT（「mb」はモーションブラーの略）と呼ばれる。[98]全反射蛍光顕微鏡（TIRF）を用いてイメージングを行う場合、励起深度は基質から約100 nmに制限されるため、基質近傍のぼやけた色素による蛍光バックグラウンドとバルク溶液中のバックグラウンドがさらに低減される。mbPAINTでは高輝度色素を使用でき、比較的弱い光励起強度下では、典型的には単一フレーム空間分解能約20 nm、単一分子運動時間分解能約20 msが得られる。これは単一タンパク質の分子分離の研究に有用である。[99]

一次鎖（抗体結合鎖）に結合した二次DNA鎖を用いることで、蛍光標識を穏やかに剥離することができ、30種類の異なるタンパク質の多重局在解析が可能になります。SUM-PAINTと呼ばれるこの手法は、シナプスタンパク質の局在を5nmの解像度でマッピングするために用いられ、興奮性シナプス、抑制性シナプス、混合シナプスの構造の違いを明らかにしています。[100]

データ取得中にフーリエ面に配置された回転位相マスクを用いて時間情報を含む歪んだ点広がり関数を分解することで、時間分解能はさらに向上しました（20倍）。この手法は、超時間分解顕微鏡法（STReM）と名付けられました。[101]

ラベルフリー局在顕微鏡法

ラベルフリー局在顕微鏡法 SPDM – 超解像顕微鏡法は、これまで検出できなかった細胞内構造を明らかにします

局在顕微鏡SPDMを使用すると、ラベルフリー細胞でも約 50 nm の範囲の細胞構造の光学解像度を実現できます。

SPDM は 2 つの異なるレーザー波長を使用することで、従来の蛍光広視野イメージング条件下では検出できない細胞物体を明らかにするとともに、自己蛍光構造の解像度を大幅に向上させます。

対照として、位置画像で検出された物体の位置は明視野画像の位置と一致している。[102]

高度に均一なプラズモニックメタ表面上の表面増強ラマン散乱信号の変動を利用したラベルフリー超解像顕微鏡法も実証されている。[103]

直接確率的光学再構成顕微鏡（dSTORM）

dSTORMは、単一の蛍光色素分子の光スイッチングを利用する。dSTORMでは、蛍光色素分子は還元・酸化緩衝系（ROXS）に埋め込まれ、蛍光が励起される。時折、確率的に、蛍光色素分子は緩衝液の酸化状態に敏感な三重項状態またはその他の暗状態に入り、そこから蛍光を発することで単一分子の位置を記録することができる。[104] dSTORM法の開発は、3つの独立した研究室でほぼ同時期に行われ、「可逆光退色顕微鏡法」（RPM）[105] 、 「基底状態消失顕微鏡法と個別分子復帰」（GSDIM）[106] 、そして現在では一般的に受け入れられているdSTORMという名称でも呼ばれている。[107]

局在顕微鏡検査用ソフトウェア

局在顕微鏡法は、数分以内に活性蛍光体の数百万枚の画像に点広がり関数（PSF）を正確に当てはめることができるソフトウェアに大きく依存しています。[108]自然科学で用いられる従来の分析手法やソフトウェアスイートは、これらの問題を計算的に解くには遅すぎて、数分で測定されるデータの処理に何時間もかかることが多いため、専用のソフトウェアプログラムが開発されています。これらの局在化ソフトウェアパッケージの多くはオープンソースであり、SMLMソフトウェアベンチマークに掲載されています。[109]分子の位置が決定されたら、その位置を表示する必要があり、表示のためのアルゴリズムがいくつか開発されています。[110]

ランダム照明顕微鏡（RIM）

ランダム照明顕微鏡法（RIM）は、レーザーによって生成されるランダムまたは疑似ランダムな広視野照明を用いる超解像イメージング技術です。この手法により、様々な未知の照明パターンで撮影された複数の低解像度フレームから高解像度画像を再構成することができ、90ナノメートルまでの解像度を実現します。RIMは、光毒性が最小限でZセクショニングが堅牢なため、特に厚みのある生体サンプルのイメージングに優れています。さらに、光学収差に対する耐性も備えているため、生物学研究において非常に効果的なツールとなっています。

超解像光揺らぎイメージング（SOFI）

単一分子局在顕微鏡法（SMLM）に固有のPSFフィッティングの必要性を回避するために、ピクセルの時間的自己相関を直接計算することが可能です。この手法は超解像光揺らぎイメージング（SOFI）と呼ばれ、同時に活性な蛍光色素分子の密度が非常に高い場合、SMLMよりも精度が高いことが示されています。

遍在する局在顕微鏡法（OLM）

遍在局在顕微鏡法（OLM）は、単一分子顕微鏡法（SMLM）技術の拡張版であり、非干渉性光源（水銀アークランプなど）と従来の落射蛍光顕微鏡セットアップを使用して高密度単一分子イメージングを可能にします。[111]深青色励起の短いバースト（405 nmレーザーの代わりに350〜380 nmを使用）により、分子の長時間の再活性化が可能になり、試験標本で90 nmの解像度が得られます。最後に、相関STEDおよびSMLMイメージングを、単純なイメージング媒体を使用して同じ生物学的サンプルで実行することができ、これにより、解像度をさらに向上させる基礎を提供できます。これらの発見は、超解像イメージングを民主化し、限られた予算でもすべての科学者が高密度単一分子イメージを生成するのに役立ちます。

連続画像による解像度向上（RESI）

シーケンシャルイメージングによる解像度向上（RESI）は、DNA-PAINTの拡張版であり、理論的には無制限の解像度を実現できます。[112]特定の標的種を識別するために1種類のラベルを使用するのではなく、同じ標的のコピーに直交するDNA配列をラベル付けします。シーケンシャル（つまり分離）イメージングにより、従来のSMLMでは重なり合っていた局在クラウドは、(1) 分離され、(2) 単一の「スーパー」局在に統合されます。その精度は、基盤となる局在の数に応じて変化します。DNA-PAINTで達成可能な局在の数は無制限であるため、RESIの理論的な解像度も無制限です。基盤となるイメージングラウンドからのRESI局在を重ね合わせることで、高解像度の合成画像が作成されます。

技術の組み合わせ

3D光顕微鏡ナノサイジング（LIMON）顕微鏡

乳房細胞におけるHer2およびHer3を用いた3Dデュアルカラー超解像顕微鏡、標準染色：Alexa 488、Alexa 568 LIMON

Vertico SMI顕微鏡を使用した光学顕微鏡ナノサイジング顕微鏡 (3D LIMON) 画像は、最初に SMI プロセスを適用し、次に SPDM プロセスを適用するという、SMI と SPDM の組み合わせによって可能になります。

SMIプロセスは、粒子の中心と顕微鏡軸方向の広がりを決定します。粒子／分子の中心は1～2nmの精度で決定できますが、この点の周りの広がりは、約30～40nmの軸直径まで測定できます。

その後、SPDMを用いて個々の粒子/分子の横方向の位置を数ナノメートルの精度で決定する。[113]

3Dデュアルカラーモードの生物学的応用として、Her2/neuおよびHer3クラスターの空間配置が達成されました。タンパク質クラスターの3方向の位置は、約25nmの精度で決定できました。[114]

統合相関光電子顕微鏡

超解像顕微鏡と電子顕微鏡を組み合わせることで、蛍光マーカーによる標識付けによって文脈情報を可視化することが可能になります。これにより、光学顕微鏡のみを使用した場合に研究者に生じる黒背景の問題を克服できます。統合システムでは、試料は両方の顕微鏡で同時に測定されます。[115]

SR-FACT

SR-FACTイメージングは​​、超解像と回折支援計算トモグラフィーを組み合わせたものです。この技術は、細胞生物学、特に細胞の インタラクトームに応用できる独自の機能を備えています。[116]

ニューラルネットワークを用いた技術の強化

近年、人工知能コンピューティングの進歩により、深層学習ニューラルネットワーク（GAN）が光学顕微鏡から抽出された写真画像の超解像強化に使用され、[117]解像度が40倍から100倍に向上しました。[118]解像度は光学顕微鏡の20倍から、ニューラルレンズを介して走査型電子顕微鏡に匹敵する1500倍に向上します。[119]これらの技術は、陽電子放出断層撮影や蛍光顕微鏡からの超解像画像に応用されています。[120]

参照

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さらに読む

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  • Cremer C, Masters BR (2013年4月). 「顕微鏡における解像度向上技術」.ヨーロッパ物理学ジャーナルH. 38 ( 3): 281– 344. Bibcode :2013EPJH...38..281C. doi : 10.1140/epjh/e2012-20060-1 .
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