ハイスループットスクリーニング
ハイスループットスクリーニングロボット

ハイスループットスクリーニング（HTS ）は、特に創薬に用いられる科学的発見の方法であり、生物学、材料科学[ 1 ]、化学[2]の分野に関連しています。[ 3 ]ロボット工学、データ処理／制御ソフトウェア、液体処理装置、高感度検出器を用いることで、ハイスループットスクリーニングは、研究者が何百万もの化学、遺伝学、薬理学の試験を迅速に実施することを可能にします。このプロセスを通して、特定の生体分子経路を調節する活性化合物、抗体、または遺伝子を迅速に認識することができます。これらの実験の結果は、医薬品設計や、特定の場所の非相互作用または役割を理解するための出発点となります。

アッセイプレートの準備

ロボットアームがアッセイプレートを扱う

HTS の主要な実験器具または試験容器はマイクロタイター プレートで、これは通常使い捨てのプラスチック製の小さな容器で、ウェルと呼ばれる小さな開いた窪みが格子状に並んでいます。一般に、HTS 用のマイクロプレートには 96、192、384、1536、3456、または 6144 個のウェルがあります。これらはすべて 96 の倍数で、8 x 12 の間隔で 9 mm 間隔で配置された元の 96 ウェル マイクロプレートを反映しています。ほとんどのウェルには、実験の性質に応じて、試験項目が含まれています。これらは、ジメチルスルホキシド(DMSO)の水溶液などに溶解したさまざまな化合物である可能性があります。ウェルには、細胞または何らかのタイプの酵素が含まれていることもあります。(その他のウェルは空であるか、実験コントロールとして使用するための純粋な溶媒または未処理のサンプルが含まれている可能性があります。)

スクリーニング施設では通常、ストックプレートのライブラリが保管されており、その内容は綿密にカタログ化されています。各プレートは研究室で作成されたもの、または市販の供給元から入手されたものです。これらのストックプレート自体は実験に直接使用されるのではなく、必要に応じて別途アッセイプレートが作成されます。アッセイプレートはストックプレートのコピーであり、ストックプレートのウェルから少量の液体（多くの場合、ナノリットル単位）をピペットで採取し、完全に空のプレートの対応するウェルに注入することで作成されます。

反応観察

アッセイの準備として、研究者はプレートの各ウェルに、タンパク質、細胞、動物の胚など、実験を行う生物学的実体を入れます。生物学的実体がウェル内の化合物を吸収、結合、または反応（または反応しない）するのに十分な時間インキュベーションが経過した後、手動または機械によって、プレートのすべてのウェルの測定が行われます。研究者が顕微鏡を使用して、（例えば）ウェル内の化合物によって引き起こされる胚の発達における変化または欠陥を探す場合、コンピュータだけでは簡単に判断できない影響を探す場合、手動測定が必要になることがよくあります。それ以外の場合は、専用の自動分析装置を使用して、ウェルに対していくつかの実験（偏光を照射して反射率を測定するなど、タンパク質結合の指標となる場合があります）を実行できます。この場合、装置は各実験の結果を数値のグリッドとして出力し、各数値は単一のウェルから得られた値にマッピングされます。大容量分析装置では、このように数分間で数十枚のプレートを測定し、数千の実験データポイントを非常に迅速に生成できます。

この最初のアッセイの結果に応じて、研究者は、興味深い結果が得られたソースウェルから液体（「ヒット」と呼ばれる）を「厳選」して新しいアッセイプレートに入れ、その後実験を再実行して絞り込んだセットに関するさらなるデータを収集し、観察結果を確認して改良することで、同じスクリーン内でフォローアップアッセイを実行できます。

自動化システム

高い保管容量と高速アクセスを実現するアッセイプレート保管用カルーセルシステム

HTSの有用性には自動化が不可欠である。通常、1台以上のロボットで構成される統合ロボットシステムが、アッセイマイクロプレートをステーション間を搬送し、サンプルと試薬の添加、混合、インキュベーション、そして最終的な読み取りまたは検出を行う。HTSシステムは通常、多数のプレートを同時に準備、インキュベーション、分析できるため、データ収集プロセスがさらに高速化される。現在、1日に最大10万種の化合物を検査できるHTSロボットが存在する。[ 4 ] [ 5 ]自動コロニーピッカーは、高スループット遺伝子スクリーニングのために数千の微生物コロニーをピッキングする。[ 6 ] uHTSまたは超高スループットスクリーニングという用語は（2008年頃）、1日に10万種を超える化合物のスクリーニングを指す。[ 7 ]

実験設計とデータ分析

HTSは、多様な化合物（低分子化合物やsiRNAなど）を迅速にスクリーニングして活性化合物を同定する能力を備えており、近年、生成されるデータ量が爆発的に増加しています。[ 8 ] その結果、HTS実験における最も基本的な課題の一つは、大量のデータから生化学的意義を見出すことであり、これは品質管理とヒット選択の両方のための適切な実験設計と分析方法の開発と採用に依存しています。[ 9 ] HTS研究は、Applied Proteomics社の最高科学責任者であるジョン・ブルーム氏が次のように述べている特徴を持つ分野の一つです。「近い将来、科学者が統計や基本的なデータ処理技術を理解していない場合、真の分子生物学者とはみなされず、単に「恐竜」になってしまうでしょう。」[ 10 ]

品質管理

HTS実験では、高品質のHTSアッセイが不可欠です。高品質のHTSアッセイの開発には、実験的アプローチと計算的アプローチの両方を統合した品質管理（QC）が必要です。QCの重要な3つの手段は、(i)適切なプレート設計、(ii)効果的な陽性および陰性の化学的/生物学的コントロールの選択、(iii)データ品質の低いアッセイを特定できるように分化の程度を測定する効果的なQCメトリクスの開発です。 [ 11 ] 適切なプレート設計は、系統的エラー（特にウェルの位置に関連するエラー）を特定し、QCとヒット選択の両方に対する系統的エラーの影響を除去/軽減するためにどのような正規化を行うべきかを決定するのに役立ちます。[ 9 ]

効果的な分析QC法は、優れた品質のアッセイの門番として機能します。典型的なHTS実験では、陽性対照と陰性対照（陰性対照など）との明確な区別が、優れた品質の指標となります。陽性対照と陰性対照の区別の程度を測定するために、多くの品質評価尺度が提案されています。信号対背景比、信号対雑音比、シグナルウィンドウ、アッセイ変動比、Z係数が、データ品質の評価に採用されています。 [ 9 ] [ 12 ] 厳密に標準化された平均差（SSMD）は、最近、HTSアッセイにおけるデータ品質の評価に提案されています。 [ 13 ] [ 14 ]

ヒット選択

HTSにおいて望ましい効果の大きさを持つ化合物はヒットと呼ばれます。ヒットを選択するプロセスはヒット選択と呼ばれます。反復のないスクリーニング（通常は一次スクリーニング）におけるヒット選択の分析方法は、反復のあるスクリーニング（通常は確認スクリーニング）におけるヒット選択の分析方法とは異なります。例えば、Zスコア法は反復のないスクリーニングに適していますが、t統計量は反復のあるスクリーニングに適しています。反復のないスクリーニングにおけるSSMDの計算方法も、反復のあるスクリーニングにおける計算方法とは異なります。[ 9 ]

反復試験のない一次スクリーニングにおけるヒット選択では、平均倍率変化、平均差、阻害率、活性率などが容易に解釈できる。しかし、これらはデータの変動を効果的に捉えることができない。Zスコア法またはSSMDは、スクリーニングにおけるすべての化合物が陰性参照と同じ変動性を持つという仮定に基づいてデータの変動を捉えることができる。 [ 15 ] [ 16 ] しかし、HTS実験では外れ値がよく発生し、Zスコア法などの方法は外れ値の影響を受けやすく、問題を引き起こす可能性がある。その結果、Z*スコア法、SSMD*、Bスコア法、分位点ベース法などの堅牢な方法がヒット選択に提案され、採用されてきた。[ 5 ] [ 9 ] [ 17 ] [ 18 ]

反復試験のあるスクリーニングでは、各化合物の変動性を直接推定できます。そのため、zスコアやz*スコアが依存するような強い仮定に依存しないSSMDまたはt統計量を使用する必要があります。t統計量とそれに関連するp値の使用に関する1つの問題は、サンプルサイズと効果サイズの両方の影響を受けることです。[ 19 ] これらは平均差がないことを検定することから得られるため、複合効果のサイズを測定するようには設計されていません。ヒット選択の場合、主な関心事は試験対象化合物の効果のサイズです。SSMDは効果のサイズを直接評価します。[ 20 ] SSMDは、他の一般的に使用される効果サイズよりも優れていることも示されています。[ 21 ] SSMDの母集団値は実験間で比較できるため、SSMDの母集団値に同じカットオフを使用して複合効果のサイズを測定できます。[ 22 ]

スループットと効率を向上させる技術

1枚または複数枚のプレートに化合物を独自に分布させることで、プレートあたりのアッセイ数を増やす、またはアッセイ結果のばらつきを減らす、あるいはその両方を実現できます。このアプローチでは、同一ウェル内のN個の化合物が通常、互いに、あるいはアッセイターゲットと相互作用して、アッセイの真のヒット検出能力を根本的に変化させることはないという単純化された仮定が用いられます。

例えば、化合物Aがウェル1、2、3、化合物Bがウェル2、3、4、化合物Cがウェル3、4、5にあるプレートを想像してください。このプレートを用いて特定の標的に対するアッセイを行うと、ウェル2、3、4でヒットがあれば、化合物Bが最も可能性の高い薬剤であることが示され、同時に、特定の標的に対する化合物Bの有効性を示す3つの測定値が得られます。このアプローチの商業的応用では、スクリーニング対象の化合物ペア間の干渉（二次的）の可能性を低減するため、2つの化合物が1つ以上のウェルを共有することのない組み合わせが用いられます。

最近の進歩

NIH化学ゲノミクスセンター（NCGC）の科学者たちは、自動化と低容量アッセイフォーマットを活用し、定量的HTS（qHTS）を開発しました。これは、各化合物の完全な濃度反応関係を生成することで、大規模な化合物ライブラリの薬理学的プロファイリングを可能にするパラダイムです。付属のカーブフィッティングおよびケモインフォマティクスソフトウェアと組み合わせることで、qHTSデータはライブラリ全体の半最大有効濃度（EC50）、最大反応、ヒル係数（nH）を算出し、新生構造活性相関（SAR）の評価を可能にします。[ 23 ]

2010年3月には、液滴ベースのマイクロ流体工学を用いた従来の技術に比べて、100万分の1のコスト（試薬量を10の−7乗倍）で、1,000倍の高速スクリーニング（10時間で1億回の反応）を可能にするHTSプロセスを実証した研究が発表されました。 [ 23 ]油で分離された液滴がマイクロプレートのウェルに取って代わり、試薬がチャネルを流れている間に分析とヒットソーティングが可能になります。

2010年に研究者らは、マイクロ流体アレイ上に配置できるシリコンシートのレンズを開発し、1台のカメラで同時に64の異なる出力チャネルの蛍光測定を可能にしました。[ 24 ] このプロセスでは、1秒あたり20万滴を分析できます。

2013年、研究者らは植物由来の低分子を用いたアプローチを発表しました。一般的に、創薬プロセスの早期段階で高品質な概念実証（POC）検証を行うことが不可欠です。この分野では、たとえ得られた化合物が医薬品開発のためにさらなる最適化を必要とする場合でも、強力で選択的かつ生体利用能の高い化学プローブの同定を可能にする技術が極めて重要です。強力で生体利用能の高いアゴニストを同定するために10年以上も標的とされてきたタンパク質である核受容体RORαは、非常に困難な創薬ターゲットの例として挙げられました。ベル型曲線のため、スクリーニング段階でヒットが確認されます。この方法は、定量的HTS法（スクリーニングとヒット確認を同時に行う）と非常に似ていますが、このアプローチを用いることでデータポイント数が大幅に削減され、10万種類以上の生物学的関連化合物を容易にスクリーニングできるという点が異なります。[ 25 ]

メルク社は、オービタルシェーカー（24時間以上の粉砕時間と少なくとも10mgの薬物化合物が必要）からレゾナントアコースティックミキサー（ResonantAcoustic Mixer）に切り替えたことで、ウェルあたりわずか1～2mgの薬物化合物で処理時間を2時間未満に短縮できたと報告しています。また、アコースティックミリングアプローチにより、従来のミリング装置では得られなかった高用量ナノ懸濁液製剤の調製が可能になったと述べています。[ 26 ]

従来のHTS創薬では精製されたタンパク質や無傷の細胞が使用されていましたが、近年の技術開発では線虫Caenorhabditis elegansやゼブラフィッシュ（Danio rerio）のような無傷の生物が使用されるようになりました。[ 27 ]

2016年から2018年にかけて、プレートメーカーは、超低接着性細胞忌避性表面の大量生産を可能にする特殊な化学薬品の製造を開始し、これにより、オルガノイドやスフェロイドなどの3D組織における癌治療薬の発見に対応するHTS適応アッセイの急速な開発が促進されました。これは、より生理学的に関連性の高いフォーマットです。[ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]

学術界における生物医学研究のためのHTSの利用増加

HTSは比較的最近のイノベーションであり、ロボット工学と高速コンピュータ技術の現代的な進歩によって実現可能になった。HTSの運用には依然として高度に専門化された高価なスクリーニングラボが必要となるため、多くの場合、中小規模の研究機関は自らHTS施設を設立するのではなく、既存のHTS施設のサービスを利用することになる。

学界では、大学が自ら創薬企業となる傾向がある。[ 31 ]通常、産業界にしかないこのような施設が、今では大学にも増えてきている。例えば、 UCLAには、オープンアクセスのHTSラボである分子スクリーニング共有リソース（MSSR、UCLA）があり、日常的に1日10万以上の化合物をスクリーニングすることができる。オープンアクセスポリシーにより、世界中の研究者が長々とした知的財産交渉をすることなく、この施設を利用できる。20万以上の低分子化合物を収録した化合物ライブラリを擁するMSSRは、西海岸の大学の中でも最大級の化合物デッキを誇っている。また、MSSRは、低分子研究を補完する完全な機能ゲノミクス機能（ゲノムワイドsiRNA、shRNA、cDNA、CRISPR）を備えています。機能ゲノミクスはHTS機能を活用し、各遺伝子をノックアウトまたは過剰発現させることで、対象となるコンテキストにおける各遺伝子の機能を調べるゲノムワイドスクリーニングを実行します。ハイスループット低分子スクリーニングとゲノムワイドスクリーニングを並行して利用することで、研究者は特定の疾患に対する標的の同定と検証、あるいは低分子の作用機序の決定を行うことができます。最も正確な結果は、「アレイ化」された機能ゲノミクスライブラリを使用することで得られます。つまり、各ライブラリには単一のsiRNAまたはcDNAなどの単一の構成要素が含まれています。機能ゲノミクスは通常、落射蛍光顕微鏡法やレーザー走査型サイトメトリーを用いたハイコンテントスクリーニングと組み合わせて行われます。

イリノイ大学にもミネソタ大学同様、HTS の施設があります。ミシガン大学生命科学研究所は、化学ゲノミクスセンター内に HTS 施設を収容しています。コロンビア大学には、生化学、細胞ベース、NGS ベースのスクリーニングに使用できる約 300,000 種類の多様な小分子と約 10,000 種類の既知の生物活性化合物を保有する HTS 共有リソース施設があります。ロックフェラー大学には 、オープンアクセスのHTS リソースセンター HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC ) があり、380,000 種類を超える化合物のライブラリを提供しています。ノースウェスタン大学のハイスループット分析研究所では、ターゲットの特定、検証、アッセイ開発、化合物のスクリーニングをサポートしています。非営利のサンフォード・バーナム・プレビス医療発見研究所も、MLPCN の一部であるコンラッド・プレビス化学ゲノミクスセンター内に長年にわたる HTS 施設を持っています。非営利のスクリプス研究所分子スクリーニングセンター（SRMSC）[ 32 ]は、MLPCN時代以降も引き続き、様々な研究機関にサービスを提供しています。SRMSCのuHTS施設は、学術界最大級のライブラリコレクションを保有しており、現在665,000件を超える低分子化合物を収蔵しています。また、複数PIによる助成金プログラムの支援のため、コレクション全体またはサブライブラリを定期的にスクリーニングしています。

米国では、国立衛生研究所（NIH）が、生物学研究に用いる革新的な化学ツールを開発するため、全国規模の低分子スクリーニングセンター・コンソーシアムを設立しました。分子ライブラリー・プローブ生産センター・ネットワーク（MLPCN）は、研究コミュニティが提供するアッセイを用いて、中央分子リポジトリに保管されている大規模な低分子ライブラリーを対照としてHTSを実施しています。さらに、NIHはメリーランド州シェイディーグローブに国立トランスレーショナルサイエンス推進センター（NCATS）を設立し、学術研究室と共同で低分子スクリーニングおよびRNAiスクリーニングを実施しています。注目すべきは、低分子スクリーニングでは1536ウェルプレートが使用されることです。これは学術研究室では稀な機能であり、各化合物を4桁から5桁の濃度で試験する定量的HTSを実施できます。[ 23 ]

参照

参考文献

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