水素-重水素交換

水素–重水素交換（H–D交換またはH/D交換とも呼ばれる）は、共有結合した水素原子が重水素原子に、あるいはその逆の反応を行う化学反応である。この反応は、交換可能な陽子と重水素に最も容易に適用でき、適切な重水素源の存在下で、触媒なしでこのような変換が起こる。酸、塩基、または金属触媒を用い、高温高圧条件下で反応させることで、交換不可能な水素原子の交換を容易にすることができる。ただし、基質が用いる条件と試薬に対して耐性を持つ必要がある。この反応は、多くの場合、分子中の交換不可能な水素原子全てが水素–重水素交換される、過重水素化反応を引き起こす。

この方法で一般的に調べられる交換性プロトンの例として、タンパク質骨格中のアミドのプロトンが挙げられます。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]この方法は、分子の様々な部分の溶媒へのアクセシビリティに関する情報、ひいてはタンパク質の三次構造に関する情報を提供します。タンパク質における水素交換を理解するための理論的枠組みは、カイ・ウルリク・リンダーストローム＝ラングによって初めて提示され、彼はH/D交換をタンパク質研究に初めて適用しました。[ 4 ]

交換反応

プロトン性溶液中では、ヒドロキシル基やアミン基などの交換可能なプロトンが溶媒とプロトン交換反応を起こす。D 2 Oが溶媒である場合、これらの位置に重水素が組み込まれる。交換反応は様々な方法を用いて追跡できる（検出の項を参照）。この交換反応は平衡反応であるため、重水素のモル量は基質の交換可能なプロトン量よりも高くなければならない。例えば、H 2 O中のタンパク質に重水素を添加するには、H 2 O溶液をD 2 Oで希釈する（例えば10倍にする）。通常、交換反応は生理的pH（7.0～8.0）で行われ、このpHではタンパク質は最も自然な立体配座状態にある。[ 5 ] [ 6 ]

H/D交換反応は、酸、塩基、または白金などの金属触媒によっても触媒されます。タンパク質の骨格アミド水素原子の場合、交換速度は平均して約pH 2.6で最小になります。中性pHで交換を行い、その後pHを急速に変化させることで、骨格アミド水素の交換速度を劇的に遅くする、つまりクエンチすることができます。反応がクエンチされるpHは分析方法によって異なります。NMRによる検出の場合、pHは約4.0～4.5に動かすことができます。質量分析による検出の場合、pHは交換曲線の最小値であるpH 2.6まで下げられます。最も基本的な実験では、反応がクエンチされる前に一定時間反応させます。

H/D交換反応を受けた分子の重水素化パターンは、非プロトン性環境下でも維持されます。しかし、タンパク質などの分子の重水素化分析法の中には、水溶液中で行われるものがあり、反応が停止した後もゆっくりとした速度で交換反応が継続します。望ましくない重水素-水素交換は逆交換と呼ばれ、これを補正するための様々な方法が考案されています。

検出

H–D交換は、水素交換の父とされるカイ・ウルリック・リンダーストローム＝ラングによって密度勾配管を用いて初めて測定されました。現代では、H–D交換は主にNMR分光法、質量分析法、中性子結晶構造解析といった手法によってモニタリングされています。これらの手法にはそれぞれ長所と短所があります。

NMR分光法

水素原子核と重水素原子核は、磁気特性が大きく異なります。そのため、NMR分光法によってそれらを区別することができます。重陽子は1 H NMRスペクトルでは観測されず、逆に陽子は2 H NMRスペクトルでは観測されません。高度に重水素化されたサンプルの1 H NMRスペクトルで観測される小さな信号は、残差信号と呼ばれます。これらを使用して、分子の重水素化レベルを計算することができます。2 H NMRスペクトルでは、この手法の感度が1 H分析に比べて低いため、類似の信号は観測されません。重陽子は通常、対応する陽子と非常によく似た化学シフトを示します。13 C NMR分光法による分析も可能です。水素（ 1/2 ）と重水素（ 1 ）の異なるスピン値によって、異なる分裂多重度が生じます。NMR分光法は、分子の部位特異的な重水素化を決定するために使用できます。

もう一つの方法はHSQCスペクトルを使用する。通常、HSQCスペクトルは、水素が重水素と交換される間の一連の時点において記録される。HSQC実験は水素に特異的であるため、信号は水素交換に伴って指数関数的に減少する。したがって、データに指数関数を当てはめ、交換定数を得ることができる。この方法は、タンパク質中の全ての残基について同時に残基特異的な情報を提供する[ 7 ] [ 8 ]。主な欠点は、対象となるタンパク質のスペクトルを事前に割り当てておく必要があることである。これは非常に手間がかかり、通常はこの方法が100万分の1以下のタンパク質に限定される。25  kDa。HSQCスペクトルの記録には数分から数時間かかるため、急速に交換されるアミドは他のパルスシーケンスを使用して測定する必要があります。

質量分析

質量分析法で測定した水素/重水素交換の実験ワークフローの図。
質量分析法（HDX-MS）による水素/重水素交換の実験ワークフローの図解。黒色の波線はタンパク質骨格を表す。青色の文字「H」は骨格アミドに結合した水素原子、赤色の文字「D」は骨格アミドに結合した重水素を表す。上から、水素で飽和したタンパク質溶液を濃重水で希釈し、この時点で骨格アミド中の水素が溶液中の重水素と交換される。一定の時間点（t 1 - t 4）で、酸性化と冷却によって交換反応は停止する。その後、得られたタンパク質サンプルは、消化および脱塩、あるいは場合によっては気相フラグメンテーションにかけられる。タンパク質が消化された場合、得られたペプチドは、質量分析法（MS）と組み合わせた液体クロマトグラフィー（LC）を用いて分離される。非重水素化対照（t 0）を含む各時間点において、各ペプチドの平均質量が測定される。次に、一般的ではありませんが、各分析対象物をフラグメンテーションにかけることで、含まれる水素と重水素の局在を詳細に特定することが可能です。解釈を容易にするため、ここではMS/MSスペクトルではc型イオンのみを示しています。ただし、他のタイプのフラグメントイオンも観測可能です。

水素-重水素交換質量分析法（HX-MSまたはHDX-MS）は、H/D交換を受けた分子の総重水素含有量を測定できます。必要なサンプル調製のため、通常は交換不可能な水素原子のみを正確に測定できると考えられています。また、気相でのH/D交換[ 9 ]またはイオン化前の溶液相でのH/D交換を行うこともできます[ 3 ] 。タンパク質のHDX-MSは、NMR分光法を用いたHDXモニタリングと比較して、いくつかの利点があります。必要なサンプル量が大幅に少なく、サンプル濃度が非常に低く（0.1 uM程度）、サイズ制限がはるかに大きく、データの収集と解釈が通常よりもはるかに迅速です[ 10 ] 。

重水素原子核は陽子だけでなく中性子も含むため、水素原子核の2倍の重さがあります。したがって、重水素をいくらか含む分子は、水素のみを含む分子よりも重くなります。タンパク質の重水素化が進むにつれて、分子量もそれに応じて増加します。重水素化に伴うタンパク質の質量変化の検出は、1991年にKattaとChaitによって初めて報告された現代のタンパク質質量分析法によって可能になりました。[ 11 ]

質量分析法による部位特異的な重水素化の決定は、NMR分光法を用いるよりも複雑である。例えば、ペプチド骨格に沿った重水素交換の位置と相対量は、交換反応を抑制した後にタンパク質をタンパク質分解にかけることで、大まかに決定することができる。次に、個々のペプチドを分析し、各ペプチド断片の全体的な重水素化を調べる。この技術を用いると、重水素交換の分解能は、消化中に生成されるペプチドのサイズによって決定される。[ 12 ] 酸性プロテアーゼであるペプシンは、タンパク質分解反応中はクエンチpHを維持する必要があるため、タンパク質分解によく用いられる。逆交換を最小限に抑えるため、タンパク質分解とそれに続く質量分析は可能な限り迅速に行う必要がある。逆交換を最小限に抑えるため、ペプシン消化物のHPLC分離は、エレクトロスプレー質量分析の直前に低温で行われることが多い。最近では、優れた分離能力を持つUPLCが用いられている。[ 13 ]

1999年に、重水素化ペプチドの衝突誘起解離（CID）フラグメンテーションをタンデム質量分析と組み合わせて使用​​することで、単一残基の分解能を達成できる可能性があることが提案されました。すぐに、CIDはペプチド内の重水素位置の「スクランブリング」を引き起こすことが発見されました。[ 14 ] [ 15 ]しかし、MALDIインソース崩壊（ISD）、電子捕獲解離（ECD）、および電子移動解離（ETD）によって生成されるフラグメンテーションは、適切な実験条件下ではほとんどまたは全くスクランブリングなしで進行します。[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]同位体標識のスクランブリングはイオンの解離前の衝突加熱によって引き起こされ、CIDはスクランブリングを引き起こしますが、衝突加熱はイオン化およびイオン輸送中にも発生する可能性があります。[ 19 ]しかし、イオン加熱を引き起こす機器パラメータを注意深く最適化することで、スクランブリングが発生しない技術を使用してフラグメンテーションを行うことができるまで、溶液相同位体標識を保持する程度まで水素スクランブリングを最小限に抑えることができます。[ 17 ] [ 18 ] [ 20 ] [ 21 ]最近では、紫外線光解離(UVPD) も、ペプチドやタンパク質内で重水素を局在化するための可能なフラグメンテーション技術として研究されています。[ 22 ] [ 23 ]この点では、結論は複雑であり、特定の条件下ではスクランブリングを受けていない UVPD フラグメントを取得することは可能ですが、UVPD フラグメンテーションステップ自体でペプチドとタンパク質の両方でスクランブリングが発生する可能性があることを示す人もいます。[ 22 ] [ 23 ]これらの明らかな矛盾を統合する理論は、ペプチドとタンパク質の UV 照射から生じる可能性がある 2 つのフラグメンテーション経路、つまり直接解離と統計解離に関係しています。[ 24 ]つまり、実験条件が直接解離に有利で、前駆イオンがフラグメンテーションの前と最中に低い内部エネルギーに保たれている場合、結果として生じるフラグメントの重水素レベルは、スクランブルされていない前駆イオンに対応する。[ 22 ]しかし、実験条件によっては、特に長い照射時間と低いガス圧の場合には、紫外線照射中に統計的解離が起こりやすく、紫外線光子によってもたらされた電子励起エネルギーの内部変換につながる可能性がある。[ 23 ]その結果、照射された分子は振動励起され、スクランブルを受ける。

中性子結晶学

高速交換種（例：ヒドロキシル基）の水素-重水素交換は、中性子結晶構造解析によって原子分解能で定量的に測定することができ、回折実験中に交換が行われる場合はリアルタイムで測定することができます。

高強度中性子ビームは、通常、核破砕中性子源などの線形加速器における核破砕によって生成されます。中性子はX線と同様に結晶を回折するため、構造解析に利用できます。生物学的環境下では電子数が1～0の水素原子はX線をほとんど回折せず、通常の実験条件下では実質的に見えません。中性子は原子核から散乱するため、水素原子や重水素原子を検出することができます。

水素原子は重水素に置換されることが一般的であり、これにより強い正の散乱因子が導入されます。タンパク質結晶中の溶媒と不安定な水素原子のみを蒸気拡散によって置換するだけで十分な場合が多くあります。このような構造では、結晶中の交換可能な重水素原子の占有率は0～100%の範囲で精緻化され、交換量を直接定量化できます。

アプリケーション

中性子散乱

多成分系の 1 つの成分を完全重水素化すると、重水素化溶媒を使用して得られるコントラストが不十分な 中性子散乱実験にコントラストを提供できます。

タンパク質構造

H/D 交換を伴うタンパク質の構造は、中性子結晶構造解析以外では決定できず、二次構造要素を定義することもできません。その理由は、タンパク質構造が交換を遅らせる仕組みに関係しています。交換速度は、溶媒のアクセシビリティと水素結合という 2 つのパラメータの関数です。つまり、分子内水素結合の一部であるアミドは、交換するとしてもゆっくりとしますが、水と水素結合したタンパク質表面のアミドは急速に交換します。溶媒から埋め込まれているが水素結合していないアミドも、交換速度が非常に遅い場合があります。溶媒のアクセシビリティと水素結合の両方が交換速度に寄与するため、結晶構造解析または NMR 構造データなしで、特定の交換速度を構造要素に帰属させることは困難です。

H-D交換法は、タンパク質を交換条件下でリフォールディングすることにより、タンパク質のフォールディング経路を解析するために用いられてきました。順方向交換実験（H→D）では、様々なリフォールディング時間後に重水素パルスを添加します。構造形成が速い部分は保護されるため交換されませんが、経路の後半でフォールディングする領域はより長い時間交換にさらされます。このように、H/D交換法は様々なフォールディングイベントの順序を決定するために用いられます。この手法の時間分解能を決定する要因は、混合効率と標識後のクエンチ速度です。

H–D 交換は、タンパク質構造[ 25 ]やタンパク質間相互作用[ 26 ]を特徴付けるために使用されてきた。交換反応は、単離されたタンパク質と複合体で実行する必要がある。次に、交換領域を比較する。領域が結合によって埋め込まれている場合、この領域のアミドは複合体で保護され、ゆっくりと交換される可能性がある。ただし、H–D 交換を使用して、すべてのタンパク質間相互作用の結合界面を見つけることはできないことを念頭に置く必要がある。一部のタンパク質間相互作用は側鎖の静電力によって駆動され、特にアミド水素がアルファヘリックスなどの安定な構造要素に位置している場合は、バックボーンのアミド水素の交換速度を変える可能性は低い。

最後に、H-D交換は、タンパク質の機能に関連するタンパク質の構造変化をモニタリングするために使用できます。翻訳後修飾、酵素活性化、薬物結合、またはその他の機能的イベントの結果として構造が変化する場合、H/D交換の変化が検出できる可能性があります。[ 27 ]

HDXsite オンライン ウェブサーバー

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参考文献

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さらに読む

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