親水性相互作用クロマトグラフィー
クロマトグラフィーの種類

親水性相互作用クロマトグラフィー（または親水性相互作用液体クロマトグラフィー、HILIC）[1]は、順相液体クロマトグラフィーの変種であり、イオンクロマトグラフィー や逆相液体クロマトグラフィー などの他のクロマトグラフィー用途と一部重複する。HILICは、親水性固定相と逆相溶出液を使用する。この名称は、アンドリュー・アルパートが1990年にこのテーマに関する論文で提案した。[2] 彼は、そのクロマトグラフィー機構を、分析対象物質が極性の上昇順に溶出する液液分配クロマトグラフィーと説明し、この結論は公表データのレビューと再評価によって裏付けられている。[3]

HILIC分割法の有効範囲

表面

HILIC分離には、極性クロマトグラフィー表面であればどのようなものでも使用できます。非極性結合シリカであっても、担体上の結合リガンド間に露出したシリカのパッチが存在するため、極めて高い有機溶媒組成で使用され、相互作用に影響を与える可能性があります。[4] この例外を除き、HILIC相は中性極性またはイオン性表面の5つのカテゴリーに分類できます。[5]

移動相

HILICクロマトグラフィーの典型的な移動相は、アセトニトリル（MeCN、ACNとも表記）と少量の水です。ただし、水と混和する非プロトン性溶媒（THFやジオキサンなど）であれば使用できます。アルコールも使用できますが、非プロトン性溶媒と水の組み合わせと同等の保持力を得るには、アルコール濃度を高くする必要があります。「水性順相クロマトグラフィー」も参照してください。

HILICでは、移動相が極性固定相表面に水分を多く含んだ層を形成し、水分の少ない移動相と対比することで、液/液抽出システムが形成されると一般的に考えられています。分析対象物質はこれらの2つの層間に分配されます。しかし、HILICは単なる分配ではなく、中性極性種間の水素供与性相互作用や、保持に使用される高有機溶媒条件下での弱い静電メカニズムも考慮されます。この点が、HILICをイオン交換クロマトグラフィーとは異なるメカニズムと区別するものです。極性が高い化合物は、極性が低い化合物よりも固定水層との相互作用が強くなります。このように、化合物の極性と溶媒和の程度に基づく分離が行われます。

添加剤

酢酸アンモニウムやギ酸アンモニウムなどのイオン性添加剤は、通常、移動相の pHとイオン強度を制御するために使用されます。HILICでは、これらの添加剤は分析対象物の極性にも影響を与え、保持時間の差を生じます。極性の高い分析対象物（例：アミノグリコシド系抗生物質（ゲンタマイシン）やアデノシン三リン酸）の場合、分析対象物が単一のイオン性状態を保つために、高濃度の緩衝液（約100 mM）が必要です。緩衝液濃度が低いと、ピーク形状の非対称化、クロマトグラフィーにおけるテーリング、および/または固定相からの回収率の低下が観察されます。中性極性分析対象物（例：炭水化物）の分離には、緩衝液は必要ありません。

100～300 mMの過塩素酸ナトリウムなど、高有機溶媒混合液（アセトニトリル約70～90% ）に溶解する他の塩は、移動相の極性を高めて溶出に影響を与えるために使用できます。これらの塩は揮発性ではないため、質量分析計を検出器として使用する場合はこの手法はあまり有用ではありません。通常、グラジエント（水の量を増加させる）で溶出を促進できます。

すべてのイオンはある程度固定相に分配されるため、再現性のある固定相を確保するには、時々水で「洗浄」する必要があります。

アプリケーション

HILICモードの分離は、極性の違いにより一部の生体分子、有機分子、および一部の無機分子を分離するために広く使用されています[11] 。代謝プロセスでは通常、細胞組織からの除去を促進するために極性基が付加されるため、代謝物を分析する場合の生物学的サンプルのサンプル調製が簡素化されたため、その有用性が高まっています。この分離技術は、グリコシル化分析[12]や生物学的医薬品中の糖タンパク質とグリコフォームの品質保証にも特に適しています[13]。 クロマトグラフィー検出器としてエレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して極性化合物を検出する場合、HILICは逆相クロマトグラフィーに比べて10倍の感度向上をもたらします[11]。これは、有機溶媒の揮発性がはるかに高いためです。

pHの選択

弱イオン性の表面化学では、pHの選択がカラムのイオン性に影響を与える可能性があります。pHを適切に調整することで、カラムと同じ電荷を持つ官能基への選択性を低下させたり、反対の電荷を持つ官能基への選択性を高めたりすることができます。同様に、pHの選択は溶質の極性にも影響を与えます。しかし、カラムの表面化学が強イオン性で、pHスケールの中間範囲（pH 3.5～8.5）のpH値に耐性がある場合、これらの分離は分析対象物の極性のみを反映するため、メソッド開発において理解しやすい場合があります。

エルリック

2008 年に、アルパートは HILIC 分離に対して ERLIC [14] (静電反発親水性相互作用クロマトグラフィー) という用語を造り出しました。これは、イオン性カラムの表面化学反応を利用して、分析対象物または分析対象物セット内の共通のイオン性極性基を反発させ、残りの極性基による分離を促進するものです。静電効果は、中性極性効果よりも 1 桁ほど化学ポテンシャルが強いです。これにより、分析対象分子セット内の共通のイオン性基の影響を最小限に抑えたり、これらのより極性の官能基による保持の度合いを減らしたりすることができ、場合によってはグラジエントの代わりにアイソクラティック分離が可能になります。彼のその後の発表では、さらに配向効果[15]について説明しており、これはイオン対通常相[16]または e-HILIC とも呼ばれ、分析対象物の特定のイオン性部分に敏感な保持メカニズム (誘引性または反発性) を反映しています。 ERLIC（eHILIC）分離は必ずしもアイソクラティックである必要はありませんが、その効果は、特に強い極性基の引力を低減し、それによって溶出条件をそれほど強くする必要がなくなり、分析対象物中の残りの極性（反対電荷のイオン性または非イオン性）官能基との相互作用が強化されることです。アンドリュー・アルパートが発明したERLICカラムに基づいて、アスパラギンの脱アミド化と異性化を分離する独自の特性を持つ新しいペプチドマッピング法が開発されました。この独自の特性は、将来、生物製剤の品質管理における質量分析法に基づく多属性モニタリングに非常に有益となるでしょう。[17]

カチオン性eHILIC

例えば、ERLIC分離に陽イオン交換（負に帯電）表面化学を用いることで、陰​​イオン（負に帯電）基（ヌクレオチドまたはホスホニル抗生物質混合物のリン酸基、あるいは修飾炭水化物のシアリン酸基）の保持への影響を低減し、これらの分子の塩基性官能基および／または中性官能基に基づいた分離が可能になります。表面上の弱イオン性官能基（カルボキシル基など）の極性を変更するには、pHをその基のpKaから2pH単位以内に調整することで容易に行うことができます。表面上の強イオン性官能基（硫酸塩やリン酸基など）の場合は、残留電荷が完全にイオン対を形成しないように、緩衝液の量を減らすことができます。一例として、12.5mM（推奨される20mM超の緩衝液ではなく）pH 9.2の移動相をポリマー性、両性イオン性、ベタインスルホン酸塩表面で使用し、ホスホニル抗生物質混合物（それぞれリン酸基を含む）を分離することが挙げられます。これにより、カラムの表面化学におけるスルホン酸官能基の影響が、pHによってわずかに減少する第四級アミンよりも強まります。これに伴い、これらの分析対象物は、中性極性HILIC表面を使用した場合よりも、カラムへの保持力が低下し、より早く、より多くの有機溶媒で溶出するようになります。これにより、負イオン質量分析による検出感度も向上します。

アニオン性eHILIC

上記と同様に、リン酸化ペプチドや硫酸化多糖分子を選択的に分離する場合など、陰イオン交換（正電荷）カラム表面化学を利用することで、一連の分析対象物に対する陽イオン（正電荷）官能基の保持への影響を低減することができます。pHを1～2の範囲に設定すると、リン酸基の3つのイオン化可能な酸素のうち2つの極性が低下し、（逆電荷の）表面化学から容易に脱離できるようになります。また、分析対象物中の負電荷を持つカルボキシル基の影響も低減します。なぜなら、これらの基は低pH値でプロトン化されるため、分子全体の極性への寄与が減少するからです。一般的な正電荷を持つアミノ基はカラム表面化学から反発されるため、これらの条件はリン酸の極性（およびその他の中性極性基）の分離における役割を高めます。

参考文献

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