免疫電子顕微鏡法

ロタウイルスに付着した金ナノ粒子の電子顕微鏡写真。小さな黒い円形の物体は、ロタウイルスタンパク質VP6に特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた金ナノ粒子です。

免疫電子顕微鏡法（免疫電子顕微鏡法と呼ばれることが多い）は免疫蛍光法と同等ですが、光学顕微鏡法ではなく電子顕微鏡法を使用します。^{[ 1 ]}免疫電子顕微鏡法は、特定の抗体に結合させることで、目的の分子、特に目的のタンパク質を識別し、その位置を特定します。この結合は、細胞をスライドに埋め込む前でも後でも形成できます。抗原と抗体の間で反応が起こり、この標識が顕微鏡下で見えるようになります。抗原が細胞表面にある場合は走査型電子顕微鏡法が実行可能なオプションですが、抗原が細胞内にある場合は、標識を見るために透過型電子顕微鏡法が必要になることがあります。 ^{[ 2 ]}

プロセス

抗原とそれぞれの抗体（通常は2つ）が切片内で相互作用する。^{[ 1 ]}透過型電子顕微鏡は抗体、ひいてはタンパク質を検出する。2つ目の抗体は通常、金に結合している。これは、金は原子番号が大きく、非常に高密度であるためである。金コロイド粒子は抗体と結合することで、抗体の正確な直径が既知であるため、抗体を可視化する。 ^{[ 3 ]}電子が顕微鏡を通過する際、この金粒子に衝突する。高密度の金原子は電子顕微鏡から放出された電子を反射し、標本内に標的粒子を出現させる。^{[ 1 ]}

もう一つの可能​​なプロセスとして、細菌由来のプロテインAが挙げられます。プロテインAは金原子を恒久的にコーティングし、抗体の定常領域に結合します。このプロセスでは、プロテインAを二次抗体の代わりとして使用するため、必要な抗体は1つだけです。プロテインAは標的タンパク質を可視化します。このように、このプロセス全体を通して標的タンパク質の局在と可視化が実現されます。^{[ 1 ]}

免疫電子顕微鏡法を用いる場合、標本は電子が透過できるように薄切片にするか、ネガティブ染色するかのいずれかの方法で観察されます。ネガティブ染色は解像度が高いですが、単独で存在する場合に認識可能な分子しか識別できません。免疫電子顕微鏡法では、ネガティブ染色は標本に小さな粒子を埋め込み、標本内の構造をより鮮明に観察します。免疫電子顕微鏡法の利点は、状況に関わらず粒子を認識できることです。^{[ 4 ]}

合併症と結果

潜在的な合併症

顕微鏡で観察する切片は、電子が通過できるように非常に薄くする必要があります。薄切片を作成するために必要な準備段階、例えば化学固定や包埋（通常はプラスチックへの包埋）などでは、いくつかの複雑な問題が発生する可能性があります。これらの過酷な準備作業は抗原を変性させ、抗体との必要な結合を阻害する可能性があります。研究者たちは、これらの問題を回避し、抗原と抗体の相互作用を維持するための特別なプロセスを発明し、活用してきました。これらの方法には、化学固定ではなく光固定、切片作製前に標本を凍結すること、高温ではなく室温で培養することなどが含まれます。^{[ 1 ]}

抗体とそれぞれの抗原、あるいは抗体と金標識との間の結合は、低濃度や立体障害の影響により、部分的にしか安全に保たれない可能性があります。ウイルスが存在しない状態で自然に生じる標識の量を考慮するには、対照群が不可欠です。 ^{[ 5 ]}

結果

免疫電子顕微鏡法の結果は通常、視覚的に定量化されます。定量分析を効果的に行うには、サンプルに特定の特徴が備わっている必要があるため、その使用頻度は限られています。これは、特定の抗体に付着した金コロイド粒子の数を確認するような状況に適用できます。^{[ 5 ]}実験が成功すれば、免疫電子顕微鏡法はタンパク質を正確に特定し、構造と機能の関係性をより深く理解することができます。これらの標識と局在化のプロセスは、研究者が様々な細胞経路やプロセスを理解するのに役立ちます。^{[ 3 ]}

EM固定および包埋プロトコルは免疫複合体形成の結果に強く影響する。電子顕微鏡の多くの固定および処理手順、例えばプラスチックエポンでの重合につながる脱水シリーズやタンパク質のグルタルアルデヒド-ホルムアルデヒド架橋などは、抗体を元の標的に結合させない。ある論文では、穏やかなEM固定および包埋手順によって活性結合部位が維持されたことで、これまで微小小胞を介して起こると考えられていた細胞質輸送は、実際には固定前に使用したペルオキシダーゼ標識抗体に起因する調製アーティファクトであることが明らかになった。Lowicryl EM切片での直接免疫金標識は、卵巣組織において小胞を伴わない細胞質輸送を示した。^{[ 6 ]} 。

1987:216A:395-401. アドバンスドエクスペクメドバイオル \1987:216A:395-401. doi: 10.1007/978-1-4684-5344-7_45.

歴史

1931年、エルンスト・ルスカ（1986年ノーベル賞受賞者）とマックス・ノールは世界初の電子顕微鏡を開発しました。この発明は走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡の発展につながり、後に免疫電子顕微鏡法の発展にも貢献しました。当初は2次元画像しか得られませんでしたが、現代の技術では3次元画像も得られます。^{[ 3 ]}

免疫電子顕微鏡法は、1940年代に2つの独立した研究グループがタバコモザイクウイルスとその抗血清を混合し、電子顕微鏡で観察したことから生まれました。当時は、追加のコントラストがなく、顕微鏡の性能も低かったため、解像度ははるかに低いものでした。実験に使用された粒子は棒状であることが知られており、両研究グループはこれらの棒状粒子が元のサイズの約2倍の大きさに凝集しているのを発見しました。それから15年以上経ち、研究者たちはウイルスに結合した単一の抗体を使用するようになりました。そしてついに、1962年にネガティブ染色抗体が登場しました。^{[ 4 ]}

アプリケーション

ウイルス

透過型電子顕微鏡法は構造に関する大まかな情報を提供することに成功していますが、ウイルスや細胞のより詳細な部分を区別することは困難です。免疫電子顕微鏡法は、ウイルス感染の診断やワクチン中のウイルス抗原の特定に役立ちます。^{[ 5 ]}免疫電子顕微鏡法は、疾患の診断や病原体の特定に十分です。一例として、基底膜のミエリン破壊を描写できることが挙げられます。この損傷は神経インパルスの遅延に関連し、広範囲にわたる認知機能や身体機能の問題を引き起こします。別の例として、皮膚病変の特定が挙げられます。この場合、科学者たちは基底膜のアンカー原線維が不十分であることを発見し、それが皮膚の脆弱性を引き起こしました。どちらの場合も、科学者たちは免疫電子顕微鏡法を用いてこれらの疾患を発見し、より深く理解するために、標的とする特定の抗原を特定しました。^{[ 7 ]}

腎生検

当初、腎生検には免疫蛍光顕微鏡法が用いられていましたが、免疫電子顕微鏡法よりも解像度が低かったです。光学顕微鏡法から電子顕微鏡法に切り替える前は、より正確な診断を確実にするために、多くの生検で追加の電子顕微鏡法が必要となることが示されました。免疫電子顕微鏡法の追加使用は、初期診断を行うためと、光学顕微鏡法の所見を確認するための両方に行われました。研究者たちは、各顕微鏡法の有効性に関する研究調査を実施することを決定しました。多くの場合、光学顕微鏡法のみでは、医師は初期診断を下すことができませんでした。中には誤診もありました。診断の種類も、この実験において重要な役割を果たしました。蛍光光学顕微鏡法は、追跡調査を必要としない診断を正確に特定しました。一方、鑑別がはるかに困難で、電子顕微鏡法を必要とする診断もありました。免疫蛍光顕微鏡法で正しい結果が得られた患者であっても、研究者たちは確認が必要であると考えました。この研究の結果は、腎生検診断において光学顕微鏡法から電子顕微鏡法に切り替える必要性を示しました。^{[ 8 ]}

参考文献

1. ロディッシュ, ハーヴェイ; バーク, アーノルド; カイザー, クリス; クリーガー, モンティ; ブレッチャー, アンソニー; プローグ, ヒッデ; アモン, アンジェリカ; マーティン, ケルシー (2016年4月1日).分子細胞生物学(第8版). WHフリーマン. ISBN 978-1464183393。
2. 「UMASSメディカルスクールのコア電子顕微鏡施設における免疫電子顕微鏡サービス」UMass Chanメディカルスクール。2013年11月2日。 2022年12月5日閲覧。
3. 「免疫電子顕微鏡法」ヒトタンパク質アトラス.
4. ミルン, ロバート G. (1991).植物病原体の電子顕微鏡法. シュプリンガー, ベルリン, ハイデルベルク. pp.  87– 102. doi : 10.1007/978-3-642-75818-8_7 . ISBN 978-3-642-75818-8. S2CID  80868758 . 2022年12月6日閲覧.
5. Gulati, Neetu M.; Torian, Udana; Gallagher, John R.; Harris, Audray K. (2019年6月). 「ウイルス抗原の免疫電子顕微鏡法」 . Current Protocols in Microbiology . 53 (1): e86. doi : 10.1002/cpmc.86 . PMC 6588173. PMID 31219685 .  
6. Templeman, KH; Wira, CR (1987). 「エストラジオール投与後の子宮上皮細胞におけるIgAおよびIgGの超微細構造的局在」 .粘膜免疫学の最近の進歩. 実験医学生物学の進歩. 第216A巻. pp.  395– 401. doi : 10.1007/978-1-4684-5344-7_45 . ISBN 978-1-4684-5346-1. PMID  3687530 .
7. Cardones, Adela Rambi G.; Hall, Russell P. (2019年1月1日). 「63 - 皮膚および粘膜の水疱性疾患」 . Clinical Immunology (第5版). Elsevier. pp. 857–870.e1. ISBN 978-0-7020-6896-6. 2022年12月6日閲覧。
8. Haas, M. (1997年1月1日). 「腎生検における日常的な電子顕微鏡検査の再評価」 . Journal of the American Society of Nephrology . 8 (1): 70– 76. doi : 10.1681/ASN.V8170 . ISSN 1046-6673 . PMID 9013450. S2CID 26970189. 2022年12月6日閲覧.