免疫沈降法

免疫沈降法（IP ）は、特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、溶液からタンパク質抗原を沈殿させる技術です。このプロセスは、数千種類の異なるタンパク質を含むサンプルから特定のタンパク質を単離・濃縮するために使用できます。免疫沈降法では、手順のどこかの段階で 抗体を固体基質に結合させる必要があります。

種類

個別タンパク質免疫沈降（IP）

既知のタンパク質に特異的な抗体を用いて、多種多様なタンパク質を含む溶液から特定のタンパク質を単離する手法です。これらの溶液は、多くの場合、植物または動物組織の粗溶解液の形態をとります。その他のサンプルとしては、体液やその他の生物由来のサンプルなどがあります。

タンパク質複合体免疫沈降（Co-IP）

完全なタンパク質複合体（抗原とそれに結合したタンパク質またはリガンド）の免疫沈降は、共免疫沈降（Co-IP）として知られています。Co-IPは、より大きなタンパク質複合体のメンバーであると考えられる既知のタンパク質を標的とする抗体を選択することで機能します。この既知のメンバーを抗体で標的とすることで、タンパク質複合体全体を溶液から分離し、複合体の 未知のメンバーを同定することが可能になる場合があります。

これは、複合体を構成するタンパク質が互いに強固に結合している場合に機能します。抗体を用いて複合体の複数のメンバーを溶液から引き抜くことができるためです。タンパク質複合体を溶液から引き抜くこの概念は、「プルダウン」と呼ばれることもあります。共免疫沈降（Co-IP）は、分子生物学者がタンパク質間相互作用を解析するために日常的に用いる強力な手法です。

  • 特定の抗体は、標的タンパク質のうちエピトープが露出している部分集団を選択することが多く、そのためエピトープを隠蔽する複合体中のタンパク質は同定できません。これは、たとえ抗体を大過剰に使用したとしても、単一の抗体でサンプルから特定のタンパク質の半分さえも沈殿させることがほとんど不可能であることからも明らかです。
  • 標的化と免疫沈降を繰り返すにつれて、同定されるタンパク質の数は増え続ける可能性があります。同定されたタンパク質は、特定の時点で単一の複合体として存在するわけではなく、異なる目的のために異なるタイミングで相互作用するタンパク質のネットワークを形成している可能性があります。
  • タンパク質複合体の異なるメンバーを標的として実験を繰り返すことで、研究者は結果を再確認することができます。プルダウンの各ラウンドでは、元の既知のタンパク質だけでなく、複合体の既に同定されている他のメンバー（さらには新たに追加されたメンバー）も回収されるはずです。このように免疫沈降を繰り返すことで、研究者はタンパク質複合体の各同定されたメンバーが有効であることを検証します。特定のタンパク質が、既知のメンバーの1つを標的とすることでしか回収できず、他のメンバーを標的とすることで回収できない場合、そのタンパク質が複合体のメンバーとして適切かどうかは疑問視される可能性があります。

クロマチン免疫沈降法（ChIP）

ChIPシーケンシングワークフロー

クロマチン免疫沈降法（ChIP）は、特定のタンパク質がゲノム上のDNA結合部位に結合して いる位置を決定するために用いられる手法です。この手法は、生細胞または組織の核内で起こるタンパク質-DNA相互作用の全体像を示します。この手法のin vivoでの性質は、同じ疑問に答えるために従来用いられてきた他の手法とは対照的です。

このアッセイの根底にある原理は、生細胞内の DNA 結合タンパク質（転写因子やヒストンなど）は、結合している DNA に架橋できるというものです。推定上の DNA 結合タンパク質に特異的な抗体を使用することで、細胞溶解物からタンパク質-DNA 複合体を免疫沈降させることができます。架橋は多くの場合、細胞（または組織）にホルムアルデヒドを塗布することによって行われますが、ジメチル 3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート-2 HCl（DTBP）などのより明確で一貫性のある架橋剤を使用する方が有利な場合もあります。[ 1 ]架橋後、細胞を溶解し、DNA を超音波処理によって 0.2～1.0 kb の長さに切断します。この時点で免疫沈降が行われ、タンパク質-DNA 複合体が精製されます。精製されたタンパク質-DNA 複合体は加熱され、タンパク質と DNA 複合体のホルムアルデヒド架橋が解除され、DNA がタンパク質から分離されます。単離された DNA 断片の同一性と量は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって決定できます。単離された断片に対して PCR を実行する際の制限は、正しい PCR プライマーを生成するために、どのゲノム領域をターゲットにしているのかを知っておく必要があることです。場合によっては、単離されたゲノム DNA をプラスミドベクターにクローニングし、そのベクターのクローニング領域に特異的なプライマーを使用するだけで、この制限を回避できます。あるいは、タンパク質がゲノム全体に結合する場所を見つけたい場合は、ChIP シーケンスが使用されます。これは、タンパク質結合部位をハイスループットでコスト効率の高い方法で位置特定できる標準技術として最近登場し、シストロムの特性評価も可能にしています。以前は、DNA マイクロアレイも使用されていました ( ChIP-on-chip または ChIP-chip )。

RNP免疫沈降法（RIPおよびCLIP）

RIPとCLIPはどちらも、結合したRNAを同定するために特定のRNA結合タンパク質を精製し、それによってリボ核タンパク質（RNP）を研究する。[ 2 ] [ 3 ] RIPでは、共精製されたRNAが抽出され、その濃縮度が対照群と比較される。これはもともとマイクロアレイまたはRT-PCRによって行われていた。CLIPでは、細胞は溶解前にUV架橋され、その後、標準的な免疫沈降法に加えて、部分的なRNA断片化、高塩洗浄、SDS-PAGE分離と膜転写、 cDNAシーケンシングによる直接RNA結合部位の同定などの追加の精製ステップが実行される。

タグ付けされたタンパク質

タグ付きタンパク質を用いたプルダウンアッセイ

免疫沈降法における主要な技術的ハードルの一つは、既知のタンパク質を特異的に標的とする抗体の作製が非常に難しいことです。この障害を回避するため、多くの研究グループが、対象タンパク質のC末端またはN末端にタグを付与しています。この方法の利点は、同じタグを様々なタンパク質に繰り返し使用でき、研究者は毎回同じ抗体を使用できることです。タグ付きタンパク質を使用する利点は非常に大きいため、この手法は、上記で詳述したすべての種類の免疫沈降法を含む、あらゆる種類の免疫沈降法で一般的に使用されています。使用されているタグの例としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タグ、FLAGタグなどがあります。プルダウンを可能にするタグの使用は便利ですが、タグ自体が本来の相互作用を不明瞭にしたり、新たな不自然な相互作用を引き起こしたりする可能性があるため、生物学的意義に関して懸念が生じます。

方法

免疫沈降の一般的な方法は、直接捕捉法と間接捕捉法の 2 つです。

直接

特定のタンパク質（またはタンパク質群）に特異的な抗体は、超常磁性マイクロビーズなどの固相基質、あるいは微小なアガロース（非磁性）ビーズ上に固定化されます。抗体が結合したビーズをタンパク質混合物に加えると、抗体の標的タンパク質が抗体を介してビーズ上に捕捉されます。つまり、免疫沈降が起こります。

間接的

特定のタンパク質、またはタンパク質群に特異的な抗体を、タンパク質混合物に直接添加します。抗体はまだ固相担体に結合していません。抗体はタンパク質混合物中を自由に浮遊し、標的に結合します。時間が経つにつれ、プロテインA/Gでコーティングされたビーズが抗体とタンパク質の混合物に添加されます。この時点で、標的に結合した抗体はビーズに付着します。

この時点で、サンプルの成分が同じになったため、直接法と間接法のプロトコルは収束します。どちらの方法も、ビーズ上に固定化された抗体に結合したタンパク質またはタンパク質複合体によって、同じ最終結果が得られます。

選択

標的タンパク質の濃度が低い場合、または抗体のタンパク質に対する特異的親和性が弱い場合、間接的なアプローチが好まれることがあります。また、抗体のタンパク質への結合速度が様々な理由により遅い場合にも間接的な方法が用いられます。ほとんどの場合、直接的な方法がデフォルトであり、推奨される選択肢です。

技術の進歩

アガロース

歴史的に、多くの科学者が免疫沈降法に用いる固相担体は、多孔性アガロースビーズ（アガロース樹脂またはスラリーとも呼ばれる）でした。この技術の利点は、アガロース粒子のスポンジ状構造（50～150μm）のほぼ全体が抗体（標的タンパク質と結合する）の結合に利用できるため、非常に高い結合容量が得られることです。また、特別な機器を必要とせず、標準的な実験装置でIPプロトコルのあらゆる側面を操作できます。極めて高い結合容量の利点は、研究者がアガロースビーズをコーティングするために使用する抗体の量と慎重にバランスを取る必要があります。抗体はコストを制限する要因となる可能性があるため、捕捉する必要があるタンパク質量（下流で実施する分析に応じて）から、その量のタンパク質に結合するために必要な抗体量（システムの非効率性を考慮して少量の過剰量を加える）、そしてさらにその特定の量の抗体に結合するために必要なアガロース量へと逆算するのが最善です。抗体の飽和が不要な場合、この技術は捕捉した標的タンパク質を極めて大量に捕捉する能力において比類のないものです。ここで注意すべき点は、「高容量の利点」が「高容量の欠点」に変わる可能性があることです。これは、セファロース／アガロースビーズの巨大な結合容量が抗体で完全に飽和していない場合に現れます。免疫沈降実験に研究者が利用できる抗体の量が、免疫沈降に使用するアガロースビーズを飽和させるのに十分ではないことがよくあります。このような場合、研究者は抗体で部分的にしかコーティングされていないアガロース粒子を得ることになり、抗体でコーティングされていないアガロースビーズの結合容量の部分は、付着するものなら何にでも自由に結合できるため、溶解液成分がビーズに非特異的に結合してバックグラウンド信号が上昇し、データの解釈が困難になる可能性があります。これらの理由から、免疫沈降のために結合させたい抗体の量とアガロースの量（結合容量の観点から）を一致させることが賢明であると主張する人もいるかもしれませんが、アガロースビーズへの非特異的結合の問題を軽減し、特異性を高める簡単な方法は溶解液を事前にクリアすることであり、これはあらゆる免疫沈降において強く推奨されます。[ 4 ] [ 5 ]

事前クリアリング

ライセートはタンパク質、脂質、炭水化物、核酸の複雑な混合物であり、IP抗体、プロテインA/G、またはビーズ支持体への非特異的結合がある程度発生し、免疫沈降標的の検出に悪影響を与えることを想定する必要があります。ほとんどの場合、各免疫沈降実験の開始時にライセートをプレクリアリング（下記「プロトコル」セクションのステップ2を参照）することで、免疫沈降前に細胞ライセートから反応性を示す可能性のある成分を除去し、これらの成分がIPビーズまたは抗体に非特異的に結合するのを防ぐことができます。基本的なプレクリアリング手順を以下に説明します。ライセートをビーズのみとインキュベートし、免疫沈降前にビーズを除去して廃棄します。[ 6 ]しかし、この方法では、IP抗体への非特異的結合が考慮されていません。非特異的結合は相当な量になる可能性があります。そのため、プレクリアの代替法として、免疫沈降で使用するのと全く同じ成分でタンパク質混合物をインキュベートする方法がある。ただし、IP抗体自体の代わりに、IP抗体と同じ抗体サブクラスの非標的無関係な抗体を使用する。[ 5 ]このアプローチは、実際の免疫沈降とできるだけ同じIP条件と成分を使用して、標的タンパク質を捕捉することなく非特異的な細胞成分を除去しようとするものである（もちろん、標的タンパク質が他のIP成分に非特異的に結合する場合は別だが、これは溶解物のプレクリアに使用した廃棄ビーズを分析することで適切に制御する必要がある）。こうすることで、非特異的結合がデータ解釈を妨げるリスクを低減しながら、標的タンパク質を免疫沈降させることができる。

超常磁性ビーズ

免疫沈降法の大部分はアガロースビーズを用いて行われますが、超常磁性ビーズを用いた免疫沈降法は、IPアプリケーションにおけるアガロースビーズの代替として人気が高まっている新しいアプローチです。アガロースとは異なり、磁性ビーズは固体で、ビーズの種類によっては球状になることもあり、抗体の結合は各ビーズの表面に限定されます。これらのビーズには、結合容量を高める多孔質中心部の利点はありませんが、磁性ビーズはアガロースビーズよりも大幅に小さく（1～4μm）、体積あたりの磁性ビーズ数が多いため、磁性ビーズは抗体結合を最適化するための効果的な表面積対体積比を備えています。

市販の磁性ビーズは、サイズの均一性に基づいて、単分散ビーズと多分散ビーズに分けられます。単分散ビーズはマイクロビーズとも呼ばれ、完全に均一であるため、すべてのビーズが結合能力や磁石への吸引レベルなど、同一の物理的特性を示します。多分散ビーズは、単分散ビーズとサイズは似ていますが、サイズのばらつきが大きく（1～4 μm）、結合能力や磁気捕捉に影響を及ぼす可能性があります。どちらのタイプのビーズも免疫沈降用途に市販されていますが、高品質の単分散超常磁性ビーズの方が、サイズ、形状、性能が一貫しているため、自動プロトコルに適しています。単分散および多分散超常磁性ビーズは、Invitrogen、Thermo Scientific、Milliporeなど多くの企業から提供されています。

アガロースビーズと磁気ビーズ

磁気ビーズの支持者は、標準的なアガロースビーズを用いた免疫沈降は1時間で行われているが、免疫沈降用途ではアガロースビーズよりも磁気ビーズの方がタンパク質結合速度が速いと主張している[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]。また、磁気ビーズは極めて大きなタンパク質複合体の免疫沈降により適しており、これはそのような複合体のサイズの上限が全くないことによると主張しているが [ 7 ] [ 8 ] [ 10 ]、この主張を裏付ける公平な証拠はない。磁気ビーズ技術の性質上、磁気分離によるサンプルへの物理的ストレスがアガロース使用時の繰り返し遠心分離に比べて少ないため、サンプル処理が少なくなり[ 8 ]、不安定な（壊れやすい）タンパク質複合体の収量増加に大きく貢献する可能性がある。[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]ただし、免疫沈降支持体を選択する際には、結合容量、試薬のコスト、追加機器の必要性、IPプロセスの自動化能力などの追加要因を考慮する必要があります。

結合能力

アガロースビーズと磁気ビーズの両方を支持する人々は、2つのビーズの結合能力の大きな差が、特定の種類のビーズに有利に働くかどうかについて議論するかもしれません。ビーズ同士を比較すると、アガロースビーズは磁気ビーズよりも表面積が著しく大きく、ビーズサイズが大きくスポンジのような構造をしているため、結合能力も高くなります。しかし、アガロースの細孔サイズは一定ではなく、非常に大きなタンパク質やタンパク質複合体が内部結合部位に結合する際に、サイズの上限が生じる可能性があります。そのため、磁気ビーズはアガロースビーズよりも大きなタンパク質やタンパク質複合体の免疫沈降に適している可能性がありますが、どちらのケースも独立した比較証拠が不足しています。

アガロースビーズの結合容量が著しく高いことは、非特異的結合の容量が大きいという欠点があると主張する人もいます。また、アガロースビーズの全結合容量を飽和させるために必要な抗体の量が多く、それがアガロースの使用による経済的なデメリットとなるため、磁気ビーズの使用を主張する人もいます。これらの主張は、実用化という文脈以外では正しいものの、こうした論理展開は、アガロースビーズと磁気ビーズのどちらを使用するかという決定が、単に結合容量だけで決まるわけではないことを示す、免疫沈降の原理における2つの重要な側面を無視しています。

まず、非特異的結合は固定化支持体上の抗体結合部位に限定されません。抗体または免疫沈降反応成分のあらゆる表面が非特異的ライセート成分と結合する可能性があるため、完全に飽和したビーズを使用した場合でも非特異的結合は発生します。そのため、免疫沈降を行う前にサンプルをプレクリアリングすることが重要です。

第二に、標的タンパク質を捕捉する能力は、使用する固定化抗体の量に直接依存するため、アガロースと磁気ビーズ免疫沈降法を比較した場合、どちらの担体も捕捉できるタンパク質の最大量は、添加する抗体の量によって制限されます。したがって、このページの アガロースセクションで前述したように、担体の種類を飽和させるかどうかは、必要なタンパク質の量によって決まります。

料金

どちらの担体を使用するかは、免疫沈降アプリケーションにおいてアガロースビーズと磁気ビーズのどちらを使用するかを決定する上で重要な要素です。磁気ビーズとセファロースビーズのコストを一見すると、セファロースビーズの方が安価に見えるかもしれません。しかし、分析規模の免疫沈降においては、使用するIP法とIP反応あたりに必要なビーズ量によっては、磁気ビーズはアガロースビーズに比べて価格競争力がある場合があります。

下記のように、IP 反応中にすべての成分をチューブに加える従来のバッチ式免疫沈降法を使用する場合、アガロースビーズの物理的な取り扱い特性により、各 IP 実験に最小量のビーズが必要になります (通常、IP あたり 25～50 μl ビーズの範囲)。これは、セファロースビーズを遠心分離によってチューブの底に濃縮し、各インキュベーション、洗浄などの後に上清を除去する必要があるためです。25～50 μl 未満のアガロースビーズのペレットはチューブの底で視覚的に識別することが困難、あるいは不可能であるため、このプロセスには絶対的な物理的制限が課せられます。磁気ビーズを使用する場合、磁気的取り扱いのため必要なビーズの最小量はなく、したがって標的抗原および IP 抗体に応じて、かなり少ない磁気ビーズを使用することが可能です。

逆に、通常のマイクロチューブの代わりにスピンカラムを使用することで、反応あたりに必要なアガロースビーズの量を大幅に削減できます。スピンカラムにはフィルターが内蔵されており、ビーズ以外のIP成分は短時間の遠心分離で通過するため、アガロースビーズの使用量を大幅に削減し、損失を最小限に抑えることができます。

装置

前述のように、免疫沈降法におけるアガロースビーズの使用には標準的な実験室設備のみが必要ですが、磁気ビーズを用いたIP反応には高出力の磁石が必要です。磁気捕捉装置は高価かもしれませんが、磁気ビーズを用いた免疫沈降法は、助成金の支給時期が迫っている場合には経済的に有利なアプローチとなる可能性があります。なぜなら、磁気ビーズを用いた30分のプロトコルは、アガロースビーズを用いた4℃での一晩インキュベーションと比較して、より短時間でより多くのデータを生成する可能性があるからです。[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

オートメーション

磁気ビーズを使用するもう一つの利点は、自動化された免疫沈降装置がより入手しやすくなってきていることです。これらの装置は、IP実施にかかる作業量と時間を削減するだけでなく、ハイスループットアプリケーションにも使用できます。

まとめ

磁気ビーズの使用には、反応速度の向上、より穏やかなサンプルハンドリング、自動化の可能性といった明確な利点がありますが、支持媒体の結合容量と製品のコストに基づいてアガロースビーズと磁気ビーズのどちらを使用するかは、対象となるタンパク質と使用するIP法によって異なります。すべてのアッセイと同様に、特定のアプリケーションに最適な方法を決定するには、経験的なテストが必要です。

プロトコル

背景

固体基質ビーズ技術を選択したら、抗体をビーズに結合させ、抗体でコーティングされたビーズを異種タンパク質サンプル（例：ホモジェナイズした組織）に添加します。この時点で、ビーズに固定化された抗体は、特異的に認識するタンパク質に結合します。これが起こると、目的の特定のタンパク質がビーズに固定化された抗体に結合するため、プロトコルの免疫沈降部分は実質的に完了します。免疫複合体をライセートから分離することは、非常に重要な一連のステップです。これは、結合していないタンパク質を除去してバックグラウンドを低減するために、洗浄ステップ中、タンパク質は互いに結合したまま（co-IPの場合）、抗体にも結合したままでなければならないためです。

アガロースビーズを使用する場合、600～3,000 xg（標準重力倍）の遠心力で短時間遠心分離し、ビーズをサンプルからペレット化する必要があります。このステップは標準的なマイクロ遠心チューブで行うことができますが、より迅速な分離、より均一なサンプルの回収率、そしてより高い回収率を得るために、液体は通過するがアガロースビーズは通過しないサイズの孔径を持つ小型スピンカラムでこのプロセスを行うことがよくあります。遠心分離後、アガロースビーズはチューブの底に非常に緩くふわふわしたペレットを形成します。不純物を含む上清は、ビーズを乱さないように慎重に除去します。その後、洗浄バッファーをビーズに加え、混合した後、再び遠心分離によってビーズを分離します。

超常磁性ビーズを用いる場合、サンプルを磁場内に置くことで、ビーズがチューブの側面に集まります。この手順は通常約30秒で完了し、残った（不要な）液体はピペットで除去されます。洗浄は、ビーズを（磁石から）洗浄液に再懸濁し、その後、チューブを再び磁石の上に置くことで、ビーズをチューブ壁に再び濃縮することで行われます。洗浄は通常、汚染物質を十分に除去するために数回繰り返されます。超常磁性ビーズのサイズが均一で、磁石が適切に設計されていれば、ビーズはチューブの側面に均一に濃縮され、洗浄液は容易かつ完全に除去できます。

洗浄後、沈殿したタンパク質を溶出し、ゲル電気泳動、質量分析、ウェスタンブロッティング、あるいは複合体の成分を同定するための様々な方法を用いて分析します。免疫沈降法のプロトコル時間は様々な要因によって大きく異なり、必要な洗浄回数や多孔質アガロースビーズの反応速度が遅いほどプロトコル時間は長くなります。

手順

  1. 細胞を溶解し、免疫沈降用のサンプルを準備します。
  2. サンプルをビーズのみまたは無関係な抗体に結合したビーズに通過させて、IP コンポーネントに非特異的に結合するタンパク質を吸収することにより、サンプルを事前にクリアします。
  3. 目的タンパク質に対する抗体と溶液をインキュベートします。抗体は、このステップの前（直接法）またはこのステップの後（間接法）に固体支持体に結合させることができます。抗体-抗原複合体が形成されるまでインキュベーションを継続します。
  4. 対象の複合体を沈殿させ、バルク溶液から除去します。
  5. 沈殿した複合体を数回洗浄します。アガロースビーズを使用する場合は洗浄の合間に遠心分離し、超常磁性ビーズを使用する場合はチューブを磁石の上に置き、上清を除去します。最後の洗浄後、上清を可能な限り除去します。
  6. 低 pH または SDS サンプル ローディング バッファーを使用して、固体支持体からタンパク質を溶出します。
  7. 対象となる複合体または抗原を分析する。これは様々な方法で行うことができます。
    1. SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に続いてゲル染色。
    2. SDS-PAGE に続いてゲル染色を行い、染色された個々のタンパク質バンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法でバンド内のタンパク質を配列決定します。
    3. 抗原と相互作用するタンパク質を別の抗体で転写してウェスタンブロットし、その後化学発光または蛍光二次抗体で検出します。

参考文献

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免疫沈降に関する図書館資料

共免疫沈降（Co-IP）技術

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