インピーダンス微生物学

インピーダンス微生物学は、培地の電気的パラメータを監視することでサンプル中の微生物数密度（主に細菌だが酵母も含む）を測定する微生物学的手法である。微生物代謝が培地の電気伝導率を変化させる能力は、スチュワート[ 1 ]によって発見され、20世紀前半にはオーカー・ブロム[ 2 ] 、パーソン[ 3 ]、アリソン[ 4 ]などの科学者によってさらに研究された。しかし、インピーダンスを監視するコンピュータ制御システムのおかげで、この手法が真価を発揮したのは1970年代後半になってからであり、フィステンバーグ・イーデン＆イーデン[ 5 ] 、ウル＆ブラウン[ 6 ] 、キャディ[ 7 ]らの研究で議論されている。

動作原理

図1: 液体媒体と直接接触する2つの電極をモデル化した等価電気回路

一対の電極を成長培地に浸すと、電極と電解質で構成されるシステムは、図 1 の電気回路でモデル化できます。ここで、R mと C mはバルク培地の抵抗と静電容量であり、R iと C iは電極-電解質界面の抵抗と静電容量です。[ 8 ]ただし、電極に適用される正弦波テスト信号の周波数が比較的低い場合 (1 MHz 未満)、バルク静電容量 C mは無視でき、システムは、抵抗 R sと静電容量 C sが直列に接続されただけのより単純な回路でモデル化できます。抵抗 R s はバルク培地の電気伝導率を占め、静電容量 C s は電極-電解質界面の容量性二重層によるものです。[ 9 ]成長期には、細菌の代謝によって、バルク培地の非荷電または弱荷電化合物が高荷電化合物に変換され、培地の電気的特性が変わります。その結果、抵抗 R sが減少し、静電容量 C sが増加します。

インピーダンス微生物学では、この手法は次のように機能します。初期の細菌濃度（C 0）が不明なサンプルを、細菌の増殖に適した温度（中温性微生物集団を対象とする場合は37～42℃）に置き、サンプルに直接接触する2つの電極を用いて、数分間隔で電気パラメータR sとC sを測定します。

細菌濃度が臨界閾値（C TH ）を下回るまでは、電気パラメータR sおよびC sは基本的に一定（ベースライン値）のままです。C TH は電極の形状、細菌株、培養培地の化学組成など、様々なパラメータに依存しますが、常に10 6～ 10 7 cfu/mlの範囲にあります。

細菌濃度が C TH を超えて増加すると、電気的パラメータはベースライン値から逸脱します (一般に細菌の場合は R sが減少し、 C sが増加しますが、酵母の場合はその逆が起こります)。

電気パラメータ R sおよび C s がベースライン値から逸脱するのに必要な時間は検出時間 (DT) と呼ばれ、初期の未知の細菌濃度 C 0を推定するために使用されるパラメータです。

図2:時間の関数としてのRs曲線と細菌濃度曲線

図 2 には、 R sの典型的な曲線とそれに対応する細菌濃度が時間に対してプロットされています。図 3 は、異なる細菌濃度で特徴付けられたサンプルの時間に対する典型的な R s曲線を示しています。 DT は細菌濃度が初期値 C 0から C THまで増加するのに必要な時間であるため、高度に汚染されたサンプルは細菌濃度の低いサンプルよりも DT の値が低くなります。 C 1、 C 2、 C 3の3つのサンプルの細菌濃度が C 1 > C 2 > C 3である場合、 DT 1 < DT 2 < DT 3となります。文献のデータから、 DT が C 0の対数の線形関数であることがわかります。[ 10 ] [ 11 ]

DT＝あ⋅ログ10⁡（C0）+B{\displaystyle DT=A\cdot \log _{10}(C_{0})+B}

ここで、パラメータAとBは、試験対象となるサンプルの種類、細菌株、使用する増菌培地の種類などに依存します。これらのパラメータは、細菌濃度が既知のサンプルセットを用いてシステムを較正し、測定されたDTから細菌濃度を推定するために使用する線形回帰直線を計算することで算出できます。

図3: 異なる細菌濃度を示すサンプルのRs曲線（時間の関数として）

インピーダンス微生物学は、細菌濃度を測定する標準的な平板計数法に比べて様々な利点があります。その特徴は、応答時間が速いことです。中温細菌の場合、応答時間は、汚染度の高いサンプル（10 5～ 10 6 cfu/ml）では2～3時間、細菌濃度が非常に低いサンプル（10 cfu/ml未満）では10時間以上です。比較すると、同じ細菌株の場合、平板計数法の応答時間は48～72時間です。

インピーダンス微生物学は、簡単に自動化して産業用機械の一部として実装したり、組み込みのポータブル センサーとして実現したりできる方法ですが、プレートカウントは、訓練を受けた人員が実験室で実行する必要がある手動の方法です。

計装

過去数十年にわたり、インピーダンス微生物学を用いて細菌濃度を測定するための様々な機器（研究室で構築されたものまたは市販のもの）が作られてきた。業界で最も売れていて広く受け入れられている機器の1つは、BiomerieuxのBactometer [ 12 ]である。1984年に発売された最初の機器は、8つの異なる培養温度を設定でき、最大512のサンプルを同時に監視できるマルチインキュベーターシステムを搭載している。Bactometerに匹敵する性能を持つ他の機器には、Malthus Instruments Ltd（英国ベリー）のMalthus [ 13 ] 、 Don Whitley Scientific（英国シップリー）のRABIT [ 14 ]、Sy-Lab（オーストリア、プルケンスドルフ）のBac Trac [ 15 ]がある。インピーダンス微生物学を用いて液体および半液体培地中の微生物濃度を測定するための ポータブルな組み込みシステムが最近提案されている。[ 16 ] [ 17 ]このシステムは、試験対象サンプルを保管する温度調節インキュベーションチャンバーと、温度調節およびインピーダンス測定用のコントローラーで構成されています。

アプリケーション

インピーダンス微生物学は、過去数十年にわたり、主に食品業界の品質保証のために、さまざまな種類のサンプル中の細菌や酵母の濃度を測定するために広く使用されてきた。いくつかの用途としては、低温殺菌牛乳の賞味期限の決定[ 18 ]や生乳の総細菌濃度の測定、[ 19 ] [ 20 ]冷凍野菜、[ 21 ]穀物製品、[ 22 ]肉製品[ 23 ]ビール[ 24 ] [ 25 ]などがある。この技術は、環境モニタリングにおいて水サンプル中の大腸菌群濃度や水域に存在する大腸菌などの他の細菌性病原体[ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]を検出したり、製薬業界では新しい抗菌剤の効率をテストしたり[ 29 ]最終製品のテストにも使用されている。

参考文献

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