ゲル内消化

ゲル内消化ステップは、プロテオーム解析におけるタンパク質の質量分析同定のためのサンプル調製工程の一部である。この手法は1992年にローゼンフェルドによって導入された。[1]この手順の基本要素には、数え切れないほどの修正と改良が加えられている。[2] [3] [4] [5] [6] [7]

ゲル内消化ステップは、主に、タンパク質内のシステインの脱色、還元およびアルキル化(R&A) 、タンパク質のタンパク質分解による切断、および生成されたペプチドの抽出という 4 つのステップで構成されます。

脱色

1Dまたは2D PAGEで分離されたタンパク質は、通常、 クマシーブリリアントブルー（CBB）や銀染色などの染色によって可視化されます。この方法の感度は大幅に低くなりますが、銀染色は分析に悪影響を与えるため、質量分析用のサンプルではクマシー染色が一般的に使用されます。ゲルから目的のタンパク質バンドを切り出した後、ほとんどのプロトコルでは、次のステップに進む前にタンパク質の脱色が必要です。

CBBの脱色溶液は、通常、緩衝 塩である重 炭酸アンモニウム（NH 4 HCO 3）と、30%～50%の有機 溶媒（主にアセトニトリル）を含む。タンパク質とCBB間の疎水性相互作用は、溶液中の有機溶媒分によって減少する。[8]同時に、溶液のイオン性部分は、色素とタンパク質の正に帯電したアミノ酸との間の静電結合を減少させる。水と有機溶媒の混合物とは対照的に、脱色効果は増加する。温度の上昇は脱色プロセスを促進する。[9]ある程度（< 10%）の脱色プロセスは、タンパク質の損失を伴う。[10]さらに、CBBの除去は、質量分析測定におけるペプチドの収量に影響を与えない。 [7] [11]

銀染色されたタンパク質バンドの場合、脱色はタンパク質に付​​着した金属銀をフェリシアン化カリウムまたは過酸化水素（H 2 O 2 ）で酸化することによって達成される。[12] [13]遊離した銀イオンはその後チオ硫酸ナトリウムと錯体を形成する。

還元とアルキル化（R & A）

ゲルの染色および脱色後、タンパク質中のシスチンまたはシステインの還元およびアルキル化（r&a）が行われることがよくあります。これにより、タンパク質のジスルフィド結合が不可逆的に切断され、三次構造の最適な展開が得られます。チオールへの還元は、ジチオトレイトール（DTT）やトリス-2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（TCEP）などのスルフィドリル基またはホスフィン基を含む化学物質との反応によって達成されます。その後、ヨードアセトアミドによるSH基の不可逆的なアルキル化の過程で、システインは安定なS-カルボキシアミドメチルシステイン（CAM；付加物：-CH 2 -CONH 2）に変換されます。これにより、システインアミノ酸残基の分子量は103.01 Daから160.03 Daに増加します。

システイン残基の還元およびアルキル化により、ペプチド収量と配列カバレッジが向上し、ジスルフィド結合の数が多いタンパク質の同定が可能になります。[14] [15]ほとんどのタンパク質にとってシステインは希少なアミノ酸であるため、r&aの手順では質量分析の改善には影響しません。[5] [10] [16] [17]システインの定量的かつ均一なアルキル化には、サンプル調製プロセスにおける修飾ステップの位置が重要です。 変性電気泳動では、ゲル内にシステイン残基を不可逆的に修飾できる遊離アクリルアミド モノマーが存在するため、電気泳動を実行する前に反応を実行することを強くお勧めします。 [18] [19] [20] [21]結果として得られるアクリルアミド付加物の分子量は 174.05 Daです。

ゲル内消化

その後、この方法の名を冠したステップであるタンパク質のゲル内消化が行われます。この手順により、タンパク質は酵素的に限られた数の短い断片に切断されます。これらの断片はペプチドと呼ばれ、特徴的な質量とパターンによってタンパク質を同定することができます。セリンプロテアーゼである トリプシンは、タンパク質分析において最も一般的に使用される酵素です。トリプシンは、塩基性アミノ酸であるアルギニンとリジンのカルボキシル末端のペプチド結合を特異的に切断します。切断部位のすぐ近くにアスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸が存在する場合、加水分解速度は低下し、切断部位のC末端にプロリンが存在する場合、加水分解は完全に阻害されます。[22]

タンパク質分解酵素の使用に伴う望ましくない副作用として、プロテアーゼの自己消化が挙げられます。これを避けるため、過去には消化バッファーにCa 2+イオンが添加されていました。 [23] [24]現在では、ほとんどの供給業者が、リジンを選択的にメチル化することで自己消化活性をアルギニン切断部位に限定した改変トリプシンを提供しています。 [25]未改変トリプシンは35℃～45℃で最も活性が高くなります。改変後は、最適温度が50℃～55℃の範囲に変更されます。[16] [26]ゲル内消化に使用されるその他の酵素には、エンドプロテアーゼLys-C、[27] [28] [29] Glu-C、[30] [31] [32 ] Asp-N [33]およびLys-Nがあります。[34] [35]これらのプロテアーゼは、例えばAsp-Nはアスパラギン酸のN末端のみを切断するなど、1つのアミノ酸のみを特異的に切断する。[27]そのため、より長いペプチドがより少なく得られる。

通常、タンパク質の完全な一次配列を1種類のプロテアーゼのみで解析することは不可能です。そのような場合には、標的タンパク質を複数の異なる酵素を用いて消化することが推奨されます。得られた重複ペプチドを用いることで、タンパク質の完全な配列をアセンブルすることが可能になります。[30] [36] [37]

消化のためには、ゲルのマトリックスに固定されたタンパク質にプロテアーゼがアクセスできるようにする必要があります。ゲルへの酵素の浸透は、アセトニトリル処理によるゲル片の脱水と、それに続くプロテアーゼを含む消化緩衝液での膨潤によって促進されると考えられています。この手順は、プロテアーゼが膨潤プロセスによってゲルに浸透するという仮定に基づいています。[2]酵素のゲルへの浸透に関するさまざまな研究により、このプロセスはほぼ完全に拡散によって駆動されることが示されています。ゲルの乾燥は、このプロセスを支持していないようです。[7] [16]そのため、ゲル内消化の改善は、たとえばゲルをできるだけ小さく切断するなどして、酵素と基質の経路を短縮することによって達成する必要があります。

通常、ゲル内消化は一晩かけて行われます。プロテアーゼとしてトリプシンを使用し、温度を37℃にした場合、ほとんどのプロトコルではインキュベーション時間は12～15時間です。しかし、消化プロセスの持続時間に関する実験では、3時間後には質量分析に十分な量の試料が得られることが示されています。[38]さらに、プロテアーゼの温度とpHの条件を最適化することで、サンプルの消化を30分で完了させることが可能です。[16]

界面活性剤（洗剤）は、ゲル中のタンパク質の可溶化と変性を助け、特に膜タンパク質などの親油性タンパク質において、消化時間を短縮し、タンパク質の切断と抽出ペプチドの数と量を増加させることができます。切断可能な洗剤は、消化後に、多くの場合酸性条件下で切断される洗剤です。そのため、洗剤の添加は質量分析に適合します。

抽出

消化が完了したら、このプロセスで生成されたペプチドをゲルマトリックスから抽出する必要があります。これは、1つまたは複数の抽出ステップで達成されます。ゲル粒子を抽出溶液でインキュベートし、上清を収集します。最初の抽出では、ほぼすべてのペプチドが回収されますが、抽出ステップを繰り返すことで、プロセス全体の収率はわずか5～10％しか増加しません。[10]異なる物理的および化学的特性を持つペプチドの要件を満たすために、塩基性または酸性溶液による反復抽出が行われます。酸性ペプチドの抽出には、消化バッファーの濃度と組成に近い溶液が使用されます。塩基性ペプチドは、目的の質量分析法に応じて、ESIの場合は低濃度のギ酸、MALDIの場合はトリフルオロ酢酸の酸性溶液で抽出されます。モデルタンパク質の研究では、ゲルからの抽出により、予想されるペプチド収量の約70～80％が回収されることが示されています。[10] 多くのプロトコルでは、抽出溶液にアセトニトリルをさらに添加しており、濃度が30% (v/v) を超えると、反応チューブやピペットチップの表面へのペプチドの吸着を低減するのに効果的です。[39]抽出液をプールし、遠心蒸発器で蒸発させます。揮発性塩である重炭酸アンモニウムを基本抽出に使用した場合、乾燥工程で部分的に除去されます。乾燥したペプチドは-20℃で少なくとも6ヶ月間保存できます。

ゲル内消化における一般的なプロトコルの主な欠点は、長時間を要することと、複数の処理ステップを必要とすることであり、コンタミネーション（特にケラチン）によるエラーが発生しやすいという点です。これらの欠点は、最適化されたプロトコルと専用の反応チューブの開発によって大幅に解消されました。[7]

取り扱いの難しさよりも深刻なのは、サンプル処理中の物質損失です。質量分析によるタンパク質分析は検出限界で行われることが多いため、たとえわずかな損失であっても分析全体の成否を左右する可能性があります。これらの損失は、様々な処理ステップにおける洗い流し、反応管やピペットチップの表面への吸着、ゲルからのペプチドの不完全な抽出、質量分析計における単一ペプチドのイオン化不良などによって生じます。[10] [40]ペプチドの物理化学的特性に応じて、損失は15～50%の範囲で変動します。ペプチド固有の不均一性のため、これまでのところ、この方法の大きな欠点に対する普遍的に有効な解決策は見つかっていません。

商用実装

ゲル内消化の商業的実装は、高スループットの研究室向けの製品と低スループットの研究室向けの製品に分ける必要があります。

高スループット

ゲル内消化法は、非常に時間と労力を要する標準的な手順であるため、一度に処理できるタンパク質スポットの数が比較的少ないという制約がありました。そのため、産業およびサービス研究室において、これらの制約を克服するための自動化への取り組みは、理想的な対象であることがわかりました。 [41]今日、ゲル内消化をハイスループットで行っている研究室では、手順は通常自動化されています。自動化の程度は、単純なピペッティングロボットから、ゲルから質量分析までの自動化ワークフローを提供する高度なオールインワンソリューションまで様々です。これらのシステムは通常、スポットピッカー、消化ロボット、およびスポッターで構成されています。

自動化の利点は、一度に処理できるスポット数が増えることに加え、手作業の削減と標準化の向上である。この方法には多くの処理ステップがあるため、手作業の結果はユーザーの器用さによって異なる可能性があり、汚染のリスクも高い。したがって、結果の品質は自動化プロセスの主な利点の一つであると言える。[42]

自動化ソリューションの欠点は、ロボット、メンテナンス、消耗品にかかるコストに加え、プロセスの複雑なセットアップです。自動ピッキングにはスポットの位置に関するデジタル情報が必要となるため、関連するスポットのゲル画像解析は、標準化された画像化手法と特殊なスキャナーを必要とするソフトウェアによって行う必要があります。この長時間の手順は、研究者が単一のゲルからいくつかの興味深いスポットを自発的に特定することを妨げ、システムをフル稼働させる必要性も生じます。その後の自動MS分析から得られるデータ量も、ハイスループットシステムのもう一つの問題です。データの品質はしばしば疑問視され、これらのデータの評価には収集時間よりも大幅に長い時間がかかるからです。[43] [44]

低スループット

上記の欠点により、自動化されたゲル内消化システムの合理的な使用は日常的な研究室に限られています。一方、タンパク質同定機器を柔軟に活用したい研究室では、ゲル内消化と質量分析において、手作業による低スループットの手法が主流となっています。業界は、この顧客層をターゲットに、ゲル内消化用の様々なキットシステムを提供しています。

キットシステムのほとんどは、ゲル内消化に必要な化学物質と酵素の単なる集合体であり、その基礎となるプロトコルは前述の手動の標準手順と変わりません。経験の浅いお客様にとって、これらの製品の利点は、多様なソリューションとプロセス用の既成プロトコルの組み合わせが確実に機能することにあります。

いくつかの企業は、ゲル内消化の取り扱いプロセスを改善して、手動でのサンプル調製でも、より簡単で標準化されたワークフローを可能にすることを試みてきました。ミリポアの Montage In-Gel Digest Kitは標準プロトコルに基づいていますが、ゲル片の取り扱いを改良された 96 ウェル マイクロプレートに移すことで、多数の並行サンプルの処理を可能にしています。ゲル内消化のさまざまなステップの溶液はこのプレートのウェルにピペットで入れられ、液体の除去はウェルの底から真空ポンプで行われます。このシステムは、マルチチャンネルピペットやピペッティング ロボットを使用することで、複数のピペッティング ステップの処理を簡素化します。実際に、ハイスループット システムのメーカーの中には、自社のロボットで動作するようにこのシステムを採用しているところもあります。これは、このキット ソリューションが、多数のサンプルを扱う研究室を対象としていることを示しています。

参照

  • ザイモグラフィーは分子生物学における無関係の技術であり、電気泳動ゲル内でのタンパク質の消化も含まれる。

参考文献

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  • Granvogl らによって説明された最適化されたゲル内消化の実験手順を示すフラッシュフィルム。
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