試験管内毒性学

科学的分析

インビトロ 毒性試験は、培養された細菌または哺乳類細胞に対する化学物質の毒性作用を科学的に分析するものです。^[1]インビトロ（文字通り「ガラスの中」）試験法は、主に潜在的に危険な化学物質を特定したり、治療薬、農薬、食品添加物などの潜在的に有用な新物質の開発の初期段階で特定の毒性がないことを確認するために使用されます

生体外毒性試験は、近年、主要な政府機関（EPA、NIEHS/NTP、FDAなど）によって、ヒトへのリスクをより適切に評価するために慎重に検討されています。毒性物質の作用機序の理解を深めるためにin vitroシステムを用いた研究や、ヒト特異的な毒性作用を明らかにするためにヒト細胞や組織を用いた研究が活発に行われています。^[2]

動物実験の改善

多くの毒物学者は、in vitro毒性試験法は、生きた動物を用いた毒性試験（ in vivo法または「in life」法と呼ばれる）よりも有用で、時間と費用対効果が高いと考えています^[3]。しかし、in vitroから in vivoへの外挿には慎重な検討が必要であり、現在も活発な研究分野となっています。

規制上の制約と倫理的配慮により、動物実験の代替手段の探求が新たな勢いを増しています。多くの場合、in vitro試験は動物実験よりも優れており、より安全な製品の開発に活用できます。^[4]

米国環境保護庁は、 ToxCast プログラム ( CompTox Chemicals Dashboardの一部)で、インシリカモデリングとヒト多能性幹細胞ベースのアッセイを使用して 1,065 種類の化学物質と薬物物質を調査し、化学物質への曝露後の細胞代謝の変化に基づいて生体内で発達する中毒物質を予測しました。 2020年に公開されたこのToxCast_STMデータセットの分析から得られた主な知見は次のとおりです。(1) 1065種類の化学物質のうち19%で発達毒性の予測が得られました。(2) ヒト出生前発達毒性のin vivo動物モデルと比較した場合、アッセイ性能は高い特異度(> 84%)と中程度の感度(< 67%)で79%～82%の精度に達しました。(3) 動物研究にはより厳格な証拠の重み付け要件が適用されたため、感度が向上しました。(4) ToxCastの特定の生化学的標的に対する最も強力な化学物質ヒットの統計的分析により、STM応答との正および負の関連性が明らかになり、標的エンドポイントとその生物学的ドメインのメカニズム的基盤についての洞察が得られました。^[5]

細胞生存率やその他の細胞毒性試験の例試験管内毒性学

細胞毒性やその他の細胞反応を調べるための試験物質を分析する方法は数多く存在します。

溶血試験

溶血試験は、化学物質、薬物、医薬品、あるいは血液に接触する医療機器や材料が赤血球を溶解する性質を調べる試験です。溶血はヘモグロビンの放出によって容易に検出されます。^[6]

MTTとMTS

MTTアッセイは細胞生存率の測定によく使用され、国際機関によって使用が承認されています。MTTアッセイは、アッセイを化学物質に導入し、その後可溶化するという2つのステップで構成されます

MTS（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム）比色in vitroアッセイは、検証済みのMTT法の改良版であり、可溶性であるという利点があります。そのため、溶解工程は不要です。

ATP

ATPアッセイの主な利点は、結果が迅速に（15分以内に）得られ、必要なサンプル細胞数が少ないことです。このアッセイは細胞を溶解し、アッセイと細胞内のATP含有量との間の化学反応によって発光が発生します。発光量は光度計で測定され、生存細胞数に換算できます

ATPアッセイでは、生きている細胞の中にATPが残っていると仮定し、
記録される発光レベルはサンプル細胞内の ATP 含有量に比例します。

ニュートラルレッド

細胞生存率のもう一つの指標は、ニュートラルレッド（NR）の取り込みです。弱い陽イオン性色素であるニュートラルレッドは、非拡散的に細胞膜を通過し、リソソーム内の細胞間に蓄積します。生細胞はNR色素を取り込みますが、損傷した細胞や死んだ細胞は取り込みません

ELISAによるサイトカイン定量

ELISAキットは、サイトカイン (IL-1、TNF アルファ、PGE2) などの炎症誘発性メディエーターのアップレギュレーションとダウンレギュレーションを調べるために使用できます。

これらのタイプの細胞応答の測定は、試験物質と試験モデル（単層細胞培養、3D 組織モデル、組織切片）との相互作用を明らかにするための窓口となります。

種類in vitro研究

大まかに言えば、実験を行うために開発されたシステムの種類に応じて、 in vitro研究には2つの異なる種類があります。一般的に使用される2種類のシステムは、a) 静的ウェルプレートシステムとb) マルチコンパートメント灌流システムです

静的ウェルプレートシステム

静的ウェルプレートまたはレイヤーシステムは、in vitro研究で広く使用されている最も伝統的かつシンプルなアッセイ形式です。これらのアッセイは非常にシンプルで、培養液中および細胞内の化学物質をモニタリングするための非常にアクセスしやすい試験環境を提供するため、非常に有益です。しかし、これらのシンプルな静的ウェルプレートアッセイの欠点は、体内で起こる細胞相互作用や生理的な体液流動状態を再現できないことです。

多区画灌流システム

細胞相互作用に関連する問題を解決するために、新しい試験プラットフォームが開発されています。これらの新しいプラットフォームは、マルチコンパートメント灌流システムに基づいており、はるかに複雑です。^[7] これらのシステムの主な目的は、生体内環境に近い細胞培養環境を提供することで、生体内メカニズムをより確実に再現することです。システム内の各コンパートメントは生体の特定の器官を表しており、したがって各コンパートメントには特定の特性と基準があります。これらのシステム内の各コンパートメントはチューブとポンプで接続されており、流体がそこを流れることで、生体内環境における血流を模倣しています。これらの灌流システムを使用する際の欠点は、静的システムと比較して、悪影響（システムの生物学的および非生物学的成分の両方が研究対象の化学物質の運命に及ぼす影響）が大きいことです。システムの非生物学的成分の影響を低減するために、すべてのコンパートメントはガラス製、接続チューブはテフロン製です。これらのin vitroシステムで起こるこれらの非特異的結合に対処するために、いくつかの速度論モデルが提案されています。^[8]

異なる培養条件をin vitroで用いることで生じる生物学的困難を改善するためには、フラスコやマイクロウェルプレートといった従来の培養モデルを改良する必要がある。マイクロテクノロジーと組織工学の同時発展により、これらの問題は「マイクロ流体バイオチップ」と呼ばれる新たなツールによって解決されている。^[9]

参考文献

^ Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (2023年1月). 「in vitroにおける生薬の細胞毒性活性の評価：レビュー」. Chemistry & Biodiversity . 20 (2): 3–27 . doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID 36595710. S2CID 255473013
^ “Tox21”. 出典:米国環境保護庁. 2012年12月12日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2011年10月29日閲覧。
^ Mahony, Catherine; Ashton, Randolph S.; Birk, Barbara; Boobis, Alan R.; Cull, Tom; Daston, George P.; Ewart, Lorna; Knudsen, Thomas B.; Manou, Irene; Maurer-Stroh, Sebastian; Margiotta-Casaluci, Luigi (2020年7月). 「反復投与全身毒性を予測するための非動物実験アプローチに関する新たなアイデア：EPAA Blue Skyワークショップ報告」. Regulatory Toxicology and Pharmacology . 114 104668. doi : 10.1016/j.yrtph.2020.104668 . PMID 32335207.
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[1] Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (2023年1月). 「in vitroにおける生薬の細胞毒性活性の評価：レビュー」. Chemistry & Biodiversity . 20 (2): 3–27 . doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID 36595710. S2CID 255473013

[2] “Tox21”. 出典:米国環境保護庁. 2012年12月12日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2011年10月29日閲覧。

[3] Mahony, Catherine; Ashton, Randolph S.; Birk, Barbara; Boobis, Alan R.; Cull, Tom; Daston, George P.; Ewart, Lorna; Knudsen, Thomas B.; Manou, Irene; Maurer-Stroh, Sebastian; Margiotta-Casaluci, Luigi (2020年7月). 「反復投与全身毒性を予測するための非動物実験アプローチに関する新たなアイデア：EPAA Blue Skyワークショップ報告」. Regulatory Toxicology and Pharmacology . 114 104668. doi : 10.1016/j.yrtph.2020.104668 . PMID 32335207.

[4] 「21世紀のビジョンとロードマップ」出典：米国国立毒性学プログラム。2011年10月29日閲覧。

[5] Zurlinden, TJ; Saili, KS; Rush, N; Kothiya, P; Judson, RS; Houck, KA; Hunter, ES; Baker, NC; Palmer, JA; Thomas, RS; Knudson, TB (2020). 「多能性ヒト（H9）幹細胞株を用いた発達毒性バイオマーカーアッセイによるToxCastライブラリのプロファイリング」. Toxicological Sciences . 174 (2): 189– 209. doi :10.1093/toxsci/kfaa014. PMC 8527599. PMID 32073639 .

[6] Sæbø PI, Bjørås M, Franzyk H, Helgensen E, Booth J (2023年2月2日). 「細胞毒性評価のための溶血アッセイの最適化」. Int. J. Mol. Sci . 24 (3): 2914. doi : 10.3390/ijms24032914 . PMC 9917735. PMID 36769243 .

[7] Leclerc E.; Sakai Y.; Fujii T. (2004). 「マイクロ流体環境におけるヒト胎児肝細胞の灌流培養」.生化学工学ジャーナル. 20 ( 2–3 ): 143– 148. Bibcode :2004BioEJ..20..143L. doi :10.1016/j.bej.2003.09.010.

[8] Ouattara DA; Choi S.-H.; Sakai Y.; Pery ARR; Brochot C. (2011). 「静的および灌流流体システムにおける非特異的結合およびADMEプロセスの特性評価のためのin vitro細胞ベースアッセイの速度論的モデリング」Toxicology Letters . 205 (3): 310– 319. doi :10.1016/j.toxlet.2011.06.021. PMID 21723928.

[9] Baudoin R.; Corlu A.; Griscom L.; Legallais C.; Leclerc E. (2007). 「in vitro肝毒性試験のためのマイクロ流体細胞バイオチップの開発動向」. Toxicology in Vitro . 21 (4): 535– 544. Bibcode :2007ToxVi..21..535B. doi :10.1016/j.tiv.2006.11.004. PMID 17188836.